Condições de crescimento e métodos de quantificação de Lactobacillus spp.

Abstract

Resumo: A microbiota vaginal saudável é caracterizada pelo predomínio de Lactobacillus spp., e a sua depleção está associada à maior susceptibilidade a infecções e colonização por bactérias patogênicas. Dentre os Lactobacillus que predominam o ambiente vaginal, Lactobacillus críspatus e Lactobacillus gasserí têm papel protetor amplamente comprovado para esse ambiente. Lactobacillus spp. mantêm um pH vaginal entre 3,5 e 4,5 pela fermentação da glicose a ácido lático, protegendo a vagina da colonização por patógenos. A principal disbiose vaginal é a vaginose bacteriana, que acomete cerca de um terço da população em idade reprodutiva. O tratamento convencional da vaginose bacteriana está relacionado a altas taxas de recorrência do quadro. Desta forma, o desenvolvimento de terapias alternativas aos antimicrobianos, como os prebióticos, tem sido explorado. A padronização dos métodos de cultura para Lactobacillus spp. é de grande importância para a testagem de candidatos prebióticos e reprodutibilidade dos ensaios inter-centro. Portanto, este estudo objetivou comparar os métodos de cultura e quantificação de L. crispatus e L. gasseri. Cepas de referência de L. crispatus (ATCC 33820) e L. gasseri (ATCC 33323) foram cultivadas em meios de cultura MRS e LAPTg. Após cultura em LAPTg, as cepas foram novamente cultivadas em LAPTg e em l A p t (depletado de glicose) e obtidas suas curvas de crescimento nos momentos 0 h, 8 h, 12 h e 24 h. As medidas para obtenção destas curvas foram: Unidades Formadoras de Colônia (UFC), densidades ópticas a 540 nm (OD540) e do pH do meio. Finalmente, foram testados meios LAPTg com pH a 6,5 e uma versão ácida a 5,5 para o plaqueamento das culturas com a finalidade de verificar se há efeito do pH do meio na contagem de UFC. A comparação do número de UFC entre MRS e LAPTg foi realizada utilizando o teste-t, enquanto as comparações das curvas de crescimento bacteriano nas diferentes condições utilizaram análise de variância (ANOVA) em nível de significância de 5%. Os resultados deste estudo demonstraram que as curvas de crescimento para as cepas foram obtidas com sucesso utilizando as medidas de OD540 e de pH. Entretanto o número de UFC/mL não diferiu entre os meios LAPT e LAPTg para L. crispatus (p=0,55), enquanto para L. gasseri foi observado menor número de UFC/mL em LAPTg em comparação ao meio sem glicose (LAPT) (p=0,30). Com o não-sucesso da contagem de UFC/mL para quantificação de Lactobacillus com o método utilizado, foi realizada nova contagem de UFC utilizando o meio de cultura LAPTg acidificado. Os resultados mostraram que a contagem de UFC em meio LAPTg e LAPTg acidificado não diferiu estatisticamente para L crispatus (p=0,385) e L. gasseri (p=0,607). Com base nos resultados, foi possível concluir que a contagem de UFC não se adequa como método de quantificação para Lactobacillus de importância vaginal utilizando os meios de cultura e condições do estudo, devendo ser substituída pelas medidas de OD540 ou pH. Ainda, deve-se considerar que métodos moleculares têm sido amplamente utilizados para a quantificação bacteriana e poderão ser empregados na testagem de candidatos a prebióticos, a depender de futuras padronizações

Abstract: The healthy vaginal microbiota is characterized by the dominance of Lactobacillus spp. The depletion of this microbial community is associated with an increased susceptibility to infections and the colonization of the vaginal environment by pathogenic bacteria. Among the Lactobacillus species that are predominant in the vaginal environment, Lactobcillus crispatus and Lactobacillus gasseri have been demonstrated to play a crucial role in maintaining a healthy vaginal ecosystem. Lactobacillus spp. maintain a vaginal pH between 3.5 and 4.5 by fermenting glucose to lactic acid, thereby preventing the colonization of the vaginal environment by pathogens. The most prevalent vaginal dysbiosis is bacterial vaginosis, which affects approximately one-third of the population of reproductive age. The conventional treatment for bacterial vaginosis has high recurrence rates. Considering this, the development of alternative therapies to antimicrobials, such as prebiotics, has been a subject of investigation. The standardization of culture methods for Lactobacillus is of great importance for the testing of prebiotic candidates and the reproducibility of intercenter trials. Accordingly, the objective of this study was to compare culture methods and quantification techniques employed to L. crispatus and L. gasseri isolation. The standard strains of L. crispatus (ATCC 33820) and L. gasseri (ATCC 33323) were cultivated in MRS and LAPTg culture media. Following the successful cultivation of the strains in LAPTg, the strains were again grown in LAPTg and in LAPT (depleted of glucose), and their growth curves were obtained at 0 h, 8 h, 12 h, and 24 h. The measurements used to obtain the growth curve were as follows: Colony- Forming Units (CFU), optical densities at 540 nm (OD540), and the pH of the medium. Finally, the effects of pH on the CFU count were investigated by plating the cultures in LAPTg media with a pH of 6.5 and an acidic version at 5.5. The comparison of the number of CFUs between MRS and LAPTg was conducted using the t-test, while the comparisons of the bacterial growth curves in the different conditions were analyzed using analysis of variance (ANOVA) at a 5% significance level. The results demonstrated that there was no statistically significant difference in CFU counts between LAPTg and acidified LAPTg media for L. crispatus (p=0.385) and L. gasseri (p=0.607). Considering these findings, it is possible to conclude that the CFU count is an inadequate method for quantifying the Lactobacillus species of vaginal importance when utilizing the culture media and conditions employed in this study. It is therefore recommended this method to be replaced by OD540 or pH measurements. Furthermore, it should be acknowledged that molecular methods have been extensively utilized for bacterial quantification and could be employed to assess prebiotic candidates, contingent on future standardization