Identification and characterization of magnolol derivatives as selective ABCG2 inhibitors and development of a simple and low-cost LED-based photodynamic therapy device for in vitro assays = Identificação e caracterização de derivados do magnolol como inibidores seletivos do transportador ABCG2 e desenvolvimento de um equipamento simples, de baixo custo e a base de LED para realização de ensaios in vitro de terapia fotodinâmica

Abstract

Resumo: O câncer é uma das doenças de maior índice mundial de mortalidade e o surgimento de resistência à quimioterapia convencional agrava ainda mais este problema. São descritos diversos mecanismos relacionados à resistência à múltiplas drogas (MDR) em câncer, porém a superexpressão de transportadores ABC é considerada a principal causa deste quadro clínico. O genoma humano codifica 48 transportadores ABC, dentre os quais 3 destacam-se quanto aos seus respectivos envolvimentos no fenótipo de MDR: Glicoproteína-P (P-gp ou MDR1), multidrug resistance associated protein-1 (MRP1) e breast cancer resistence protein (BCRP ou ABCG2). Estes três transportadores são capazes de reconhecer e promover o efluxo de uma ampla gama de agentes antineoplásicos, quimicamente não relacionáveis entre si. Por esta razão, novos compostos vêm sendo estudados para inibir a atividade de transporte mediada por essas proteínas. Apesar de ser um dos três transportadores ABC com maiores índices de envolvimento na MDR, o ABCG2 ainda não possui inibidores para serem direcionados às etapas clínicas do desenvolvimento de novos fármacos, tornando-se relevante a identificação e caracterização de novas moléculas que possam atuar como inibidores seletivos desta proteína. Neste contexto, 13 derivados de magnolol vem sendo testados quanto à capacidade de inibir o transportador ABCG2.Dois compostos, CT_M10 e CT_M15, apresentaram capacidade inibitória frente ao transportador com valores de IC50 de 22,6 e 9,5 µM, respectivamente. Ambos os compostos foram seletivos para ABCG2 quando testados frente a transportador P-gp. Além disso, ambos os compostos apresentaram citotoxicidade consideravelmente baixa, destacando-se o CT_M15 com valor de IG50 de citotoxicidade superior a 100 µM e razão terapêutica (RT) (citotoxicidade / inibição), superior a 10. Foi demonstrado que a ligação do CT_M15 ao transportador ABCG2 apresenta efeitos sobre a atividade ATPase e termoestabilidade da proteína, desestabilizando sua estrutura. O composto também foi capaz de inibir o efluxo de diferentes substratos. Ademais, CT_M15 não demonstrou impactos nos níveis de expressão de mRNA de ABCG2, promoveu aumento no reconhecimento do anticorpo conformacional 5D3 e apresentou inibição do tipo mista. Por fim foram identificados, através de docking molecular, diferentes sítios de ligação entre o substrato mitoxantrona e CT_M15. Estes dados demonstram que o CT_M15 é um promissor inibidor seletivo de ABCG2, apresentando mínima citotoxicidade, uma característica importante a ser buscada em futuros ensaios pré-clínicos. Ainda buscando alternativas para combater a resistência à quimioterapia, o presente estudo descreveu um equipamento a base de LED, simples e de baixo custo para realização de terapia fotodinâmica com todos os detalhes de construção e programação. Como prova de conceito, o equipamento foi utilizado para promover um aumento na sensibilização de células HeLa tratadas com o fotossensibilizador verteporfin. Os resultados foram comparados com um equipamento comercial a base de LED (LumaCare®) e os efeitos citotóxicos observados foram associados à geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), demonstrando que o equipamento representa uma promissora alternativa para estudos in vitro de PDT.

Abstract: Cancer is one of the diseases with the highest mortality rate in the world and the emergence of resistance to the conventional chemotherapy exacerbates this problem. Several mechanisms related to multidrug resistance (MDR) in cancer have been described, however the overexpression of ABC transporters is considered the main cause of this clinical condition. The human genome encodes 48 ABC transporters, among which 3 are highlighted for their involvement in the MDR phenotype: Pglycoprotein (P-gp or MDR1), multidrug resistance associated protein-1 (MRP1) and breast cancer resistance protein (BCRP or ABCG2). These three transporters can recognize a broad spectrum of chemically unrelated antineoplastic agents and promote their efflux; therefore, new compounds have been studied to inhibit the transport mediated by these proteins. Although ABCG2 is one of the three ABC transporters with the highest involvement in MDR, there are still no inhibitors to be forwarded to clinical steps of drug development, which makes the identification and characterization of new selective inhibitors of this protein very important. In this context, 13 magnolol derivatives have been tested for their ability to inhibit the ABCG2 transporter. Two compounds, CT_M10 and CT_M15, were capable to inhibit the transport activity, showing IC50 values of 22.6 and 9.5 µM, respectively. Both compounds were selective toward ABCG2 when tested against P-gp. In addition, both inhibitors showed a very low-cytotoxic effect, especially CT_M15 which showed an IG50 value of cytotoxicity higher than 100 µM and a therapeutic ratio (TR) (cytotoxicity/inhibition) higher than 10. CT_M15 binding has been shown to affect the ATPase activity and thermostability of ABCG2, destabilizing the protein structure. This compound was capable to inhibit the efflux of different substrates. In addition, CT_M15 showed no effects on mRNA expression levels of ABCG2, promoted an increase on the recognition of 5D3 conformational antibody and performed a mixed type of inhibition. Finally, it was identified by molecular docking different binding sites between the substrate mitoxantrone and CT_M15. These data demonstrate that CT_M15 is a promising selective inhibitor of ABCG2 showing minimal cytotoxicity, an important feature to pursue in future preclinical trials. Still looking for alternatives to combat resistance to chemotherapy, the present study described a simple and low-cost LED-based device for performing photodynamic therapy (PDT) with all construction and programming details. As a proof of concept, the equipment was used to promote an increase in the sensitization of HeLa cells treated with the photosensitizer verteporfin. The results were compared with a commercial LED-based device (LumaCare®) and the observed cytotoxic effects were associated with the generation of reactive oxygen species (ROS), demonstrating that the device represents a promising alternative for in vitro studies of PDT.