Bioprospecção de actinobactérias endofíticas da planta Hymenachne amplexicaulis provenientes do Pantanal Sul-matogrossense

Abstract

Resumo: Actinobactérias endofíticas habitam o interior das plantas, sem causar danos, podendo inclusive fornecer a elas proteção através da produção de metabólitos secundários. Os metabólitos produzidos por actinobactérias apresentam múltiplos potenciais de ação, sendo usados como fármacos para o tratamento de infecções causadas por bactérias e fungos. Devido a necessidade de novos medicamentos para o tratamento de bactérias multi-resistentes e tumores, a busca por novas moléculas bioativas tem crescido, especialmente de fontes ainda inexploradas. Um dos biomas brasileiros ainda pouco explorados é o Pantanal, que abriga grande diversidade de plantas e animais, embora existam poucos relatos sobre a comunidade endofítica de plantas desse ambiente. Uma planta nativa e abundante nessa região e sem relatos de bioprospecção da comunidade endofítica é a Hymenachne amplexicaulis (capim-capivara), que é semi-aquática e considerada invasora em algumas regiões do mundo. Tal característica pode ser um indicativo de uma comunidade endofítica que contribui para seu potencial em invadir e se estabelecer, através da produção de metabólitos secundários que favorecem a competição por meio de alelopatia. Neste contexto, este trabalho objetivou isolar e identificar actinobactérias endofíticas da planta Hymenachne amplexicaulis bem como avaliar o potencial desses isolados quanto a produção de metabólitos secundários com atividade citotóxica contra células tumorais e antimicrobiana contra bactérias patogênicas humanas. A partir de fragmentos de raízes de H. amplexicaulis 10 actinobactérias foram isoladas, e identificadas utilizando o sequenciamento parcial do gene 16s rRNA, como pertencentes a quatro gêneros: Streptomyces, Microbispora, Leifsonia e Verrucosispora. Os metabólitos secundários foram produzidos a partir de fermentação por 10 dias (36°C e 180 rpm) em Erlenmeyers (250 mL) contendo 100 mL de meio de cultura SG. Parte dos extratos secos foram diluídos em DMSO nas concentrações de 0,2, 2 e 200 pg/mL para a avaliação da atividade citotóxica contra as células de melanoma murino B16-F10 e de fibroblasto murino BALB/3T3. Outra parte dos extratos secos foram diluídos em metanol, a 10 mg/mL, para o teste de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima, contra os patógenos clínicos: Staphylococcus aureus resistente à meticilina fMRSA), Acinetobacterbaumannii, Klebsiella pneumoniae produtora da enzima KPC (K. pneumoniae carbapemase), Pseudomonas aeruginosa, Enterococos Resistente à Vancomicina (VRE) e Salmonella typhimurium. Os extratos produzidos a partir dos isolados Streptomyces albidoflavus CMRP4852 e Verrucosispora sp. CMRP4860 apresentaram atividade contra a bactéria MRSA (CIM: 1.5 pg/ml e 13 pg/ml, respectivamente) e contra a bactéria VRE (MIC: 40 pg/ml para ambos extratos). Esses extratos (200 pg/ml) também apresentaram ação citotóxica frente células tumorais de melanoma murino B16-F10, mas não apresentaram efeito significativo em células normais, mostrando especificidade para as células tumorais. O extrato produzido a partir do isolado CMRP4854 (S. albidoflavus) foi o único a proporcionar resultados promissores frente a bactéria Gram-negativa A. baumanii, com valores de CIM de 4.4 ^g/ml. Esse é o primeiro relato do isolamento de actinobactérias endofíticas de raízes da planta H. amplexicaulis. Os resultados obtidos a partir dos ensaios com os extratos sugerem que essa espécie, mesmo sendo potencialmente invasora, possui potencial biotecnológico que deve ser melhor explorado.

Abstract: Endophytic actinobacteria inhabit the plant tissues, without causing damage, and may even provide protection through the production of secondary metabolites. The metabolites produced by actinobacteria have multiple action potentials, being used as drugs for the treatment of infections caused by bacteria and fungi. Due to the need for new drugs for the treatment of multi-drugs resistant bacteria and different types of cancer, the search for new bioactive molecules has grown, especially from unexplored sources. One of the Brazilian biomes still little explored is the Pantanal, which harbor a great diversity of plants and animals, although there are few reports about the endophytic community of this environment. A native and abundant plant in this region, but without reports on its endophytic community, is Hymenachne amplexicaulis (capim-capivara), a semi-aquatic plant, considered invasive in some regions of the world. This characteristic may be an indicative of an endophytic community that contributes to its potential to invade and establish itself, through the production of secondary metabolites that favor competition through allelopathy. In this context, this study aimed to isolate and identify endophytic actinobacteria from the plant Hymenachne amplexicaulis, as well as to evaluate the potential of these isolates in the production of secondary metabolites with cytotoxic activity against tumor cells and antimicrobial activity against human pathogenic bacteria. From root fragments of H. amplexicaulis 10 actinobacteria were isolated and identified by partial sequencing of the 16s rRNA gene, and belong to four genera: Streptomyces, Microbispora, Leifsonia and Verrucosispora. Secondary metabolites were produced from fermentation for 10 days (36°C and 180 rpm) in Erlenmeyers (250 mL) containing 100 mL of SG culture medium. Part of the dry extracts were diluted in DMSO in concentrations of 0.2, 2 and 200 pg / mL in order to evaluate the cytotoxic activity against murine melanoma B16-F10 cells and murine fibroblast BALB / 3T3 cells. Another part of the dry extracts was diluted in methanol, at 10 mg / mL, for the tests of Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC), against clinical pathogens: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae producer of the enzyme KPC (K. pneumoniae carbapemase), Pseudomonas aeruginosa, Vancomycin Resistant Enterococci (VRE) and Salmonella typhimurium. The extracts produced from the Streptomyces albidoflavus CMRP4852 and Verrucosispora sp. CMRP4860 showed activity against MRSA (MIC: 1.5 pg / ml and 13 pg / ml, respectively) and against VRE (MIC: 40 pg / ml for both extracts). These extracts (200 pg / ml) also had a cytotoxic action against tumor cells of murine melanoma B16-F10, but had no significant effect on normal cells, showing specificity for tumor cells. The extract produced from the isolate CMRP4854 (S. albidoflavus) was the only one to provide promising results against the Gram-negative bacterium A. baumanii, with MIC values of 4.4 pg / ml. This is the first report of the isolation of endophytic actinobacteria from the roots of H. amplexicaulis. The results obtained in the tests with the extracts suggest that this species, despite being potentially invasive, has biotechnological potential that should be better explored.