Modulação do secretoma de células-tronco mesenquimais visando o aumento do potencial regenerativo

Abstract

Resumo: As células-tronco mesenquimais (CTMs) são células com capacidade de se autorrenovar, proliferar e se diferenciar em alguns tipos celulares de origem mesodermal. Essas células podem ser isoladas de várias fontes, como o tecido adiposo (ASCs) e placenta (PLSCs). O potencial terapêutico das CTMs é atribuído em grande parte ao mecanismo parácrino, que pode ser modulado pelo microambiente. A Indoleamina-2,3-dioxigenase1 (IDO1) é uma enzima que desempenha um papel em processos de imunomodulação. Embora as CTMs não expressem IDO1 de forma constitutiva, é possível induzir a expressão dessa enzima por meio de diferentes abordagens. Além disso, as CTMs derivadas de diferentes fontes podem apresentar variações em suas características biológicas e funcionais relacionadas com o seu tecido de origem. O objetivo deste estudo foi buscar estratégias de condicionamento de ASCs e PLCs a fim de potencializar o secretoma dessas células e avaliar a sua capacidade pró-regenerativa. Para isso foram utilizadas duas abordagens: (a) modificação genética transiente para aumento da expressão de IDO1; (b) modulação das condições de cultivo visando induzir a expressão de IDO1 e/ou características pró-regenerativas e analisar as diferentes respostas celulares derivadas dessas células e condições. As ASCs foram submetidas ao processo de transfecção com os plasmídeos pcDNA3.1/myc-HisB-IDO1 e pcDNA3.1/myc-HisB (controle negativo). Tanto as ASCs, quanto as PLSCs e a linhagem de fibroblastos dermais neonatais humanos (NHDF, Lonza™) foram expostas a diferentes condições de estresse em cultivo, como hipóxia (5% de teor de oxigênio) e privação nutricional. Além disso, as ASCs foram tratadas com Interferon-? (IFN-?). A expressão de IDO1 foi analisada por meio de SDS-PAGE seguida por western blotting. Para análise do perfil proteico das ASCs e PLSCs, as células foram cultivas em meio de privação nutricional e privação nutricional + hipóxia. O secretoma foi submetido a análise de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS). Os resultados foram analisados por ferramentas de bioinformática. Para o ensaio de migração celular in vitro, foram utilizadas células da linhagem de queratinócitos humanos transformados espontaneamente (HaCaT) da Lonza™. Os resultados obtidos demonstraram que as ASCs respondem ao processo de transfecção, apresentando aumento da expressão endógena de IDO1. As condições de estresse testadas não foram eficientes para aumentar a expressão de IDO1 nas células analisadas, mas o tratamento com IFN-? demostrou ser eficaz no aumento da expressão de IDO1 em ASCs. Apesar das limitações do estudo, os resultados sugerem que as CTMs são sensíveis a alterações no microambiente. Ao analisar o perfil proteico do secretoma das CTMs submetidas a diferentes condições de cultivo, observou-se que as células analisadas apresentam um perfil proteico similar, que pode relacionar-se com funções fisiológicas dessas células. Realizando as análises de ontologia gênica das amostras, encontrou-se termos enriquecidos relacionados com as alterações metabólicas induzidas por privação nutricional. No ensaio de migração celular in vitro, o secretoma derivado de PLSCs aumentou a taxa de migração celular em relação ao controle. Pode concluirse que as células respondem de forma satisfatória ao estresse induzido pela condição de privação nutricional e o secretoma dessas células possui a capacidade de aumentar a migração celular.

Abstract: Mesenchymal stem cells (MSCs) are cells with the ability to self-renew, proliferate, and differentiate into some cell types of mesodermal origin. These cells can be isolated from various sources, such as adipose tissue (ASCs) and placenta (PLSCs). The therapeutic potential of MSCs is largely attributed to the secretion mechanism of bioactive factors, which can be modulated by the microenvironment. Indoleamine-2,3-dioxygenase1 (IDO1) is an enzyme that plays an important role in immunomodulation processes. Although MSCs do not constitutively express IDO1, it is possible to induce the expression of this enzyme through different approaches. Furthermore, MSCs derived from different sources may present variations in their biological and functional characteristics related to their tissue of origin. Uncovering these characteristics could bring advances to regenerative medicine. This study aimed to search for conditioning strategies for ASCs and PLSCs to improve the secretome of these cells and evaluate their pro-regenerative capacity. For this, two approaches were used: (a) transient genetic modification to increase IDO1 expression and (b) modulation of culture conditions aiming to induce the expression of IDO1 and/or proregenerative characteristics and analyze the different cellular responses derived from these cells and conditions. The ASCs were subjected to the transfection process with the plasmids pcDNA3.1/myc-HisB-IDO1 and pcDNA3.1/myc-HisB (negative control). Both ASCs, PLSCs, and the human neonatal dermal fibroblast line (NHDF, Lonza™) were exposed to different stress conditions in culture, such as hypoxia (5% oxygen concentration) and nutritional deprivation. Furthermore, ASCs were treated with Interferon-? (IFN-?). IDO1 expression was analyzed using SDS-PAGE followed by western blotting. To analyze the protein profile of ASCs and PLSCs, the cells were cultured in nutritional deprivation and nutritional deprivation + hypoxia and the secretome was subjected to liquid chromatography analysis coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and the results were analyzed using bioinformatics tools. For the in vitro cell migration assay, cells from the spontaneously transformed human keratinocyte lineage (HaCaT) from Lonza™ were used. The main results obtained demonstrated that ASCs respond to the transfection process, showing increased endogenous expression of IDO1. The stress conditions tested were not efficient in increasing IDO1 expression in the cells analyzed, but treatment with IFN-? proved to be effective in increasing IDO1 expression in ASCs. Despite the limitations of the study, the results suggest that MSCs are sensitive to changes in the microenvironment. When analyzing the protein profile of the secretome of MSCs subjected to different cultivation conditions, it was observed that ASCs, PLSCs and fibroblasts present a similar protein profile, which can be related to the physiological functions of these cells. When carrying out gene ontology analyses of the samples, several enriched terms were found related to metabolic changes induced by nutritional deprivation. In the in vitro cell migration assay, the secretome derived from PLSCs was efficient in increasing the cell migration rate compared to the control. It is concluded that the cells respond satisfactorily to the stress induced by nutritional deprivation and the secretome of these cells has the capacity to increase cell migration.