Determinação de p-nitrofenol e atividade enzimática em solos de diferentes classes do Estado do Paraná

Abstract

Resumo: A determinação da atividade enzimática de ??-glicosidase, arilsulfatase e fosfatase ácida em solos baseia-se na quantificação espectrofotométrica visível do pnitrofenol produzido a partir da hidrólise catalítica de substratos contento o grupo pnitrofenil, específicos para cada uma dessas enzimas. Os solos com mais matéria orgânica e argila devem adsorver boa parte do p-nitrofenol gerado durante a incubação, resultando em sua baixa determinação por espectrofotometria. Por outro lado, as diferenças de resultados obtidos pela calibração do método de padrão externo com os resultados obtidos com o método de calibração de adição-padrão (baseado na adição de amostra de solo em cada ponto da curva-padrão) pode revelar os possíveis efeitos da matriz do solo sobre a determinação do p-nitrofenol. Portanto, os objetivos desse trabalho foram i) verificar a existência de um efeito matriz na quantificação espectrofotométrica final do p-nitrofenol, sua eventual magnitude e implicações na determinação da atividade enzimática de solos, e ii) propor uma metodologia alternativa de calibração instrumental nos casos em o efeito matriz é significativo. Para o estudo, foram coletadas amostras de solo em 18 localidades da região do Planalto e do Litoral do Estado do Paraná, de áreas de florestas nativas, campos agrícolas, pastagem, áreas de pousio pós-corte de Pinus elliotti e manguezal, com classes de solos contrastantes. As amostras foram caracterizadas quanto aos seus parâmetros físicos e químicos e suas atividades enzimáticas foram determinadas a partir da determinação de p-nitrofenol. Os valores de p-nitrofenol obtidos pelas curvas de calibração com padrões externos foram mais baixos do que os valores obtidos com o método de adição padrão e o método do ponto único. Portanto, houve indicação de que existe um efeito da matriz do solo sobre a determinação de pnitrofenol, utilizado como analito nos métodos de determinação da atividade enzimática de ß-glicosidase, arilsulfatase e fosfatase ácida. As diferenças foram significativas nos resultados de atividade da de ß-glicosidase em amostras de solo com alto teor de matéria orgânica e argila. O efeito de matriz do solo foi maior sobre os resultados da atividade de ß-glicosidase em relação às atividades de arilsulfatase e fosfatase ácida. Essa diferença pode ser em função da combinação das soluções de tamponamento e terminação de cada enzima analisada. Para situações de alto teor de argila e matéria orgânica do solo, as análises indicaram que é possível corrigir os efeitos da matriz do solo nas determinações p-nitrofenol utilizando tanto o método de adição padrão quanto o método de calibração de ponto único. Entretanto, as altas correlações dos três métodos corroborou a validade de uso do padrão externo para estudos de qualidade da saúde do solo.

Abstract: The determination of the enzymatic activity of ß-glucosidase, arylsulfatase, and acid phosphatase in soils is based on the visible spectrophotometric quantification of p-nitrophenol produced from the catalytic hydrolysis of substrates containing the pnitrophenyl group, specific to each of these enzymes. Soils with higher organic matter and clay content are expected to adsorb a significant portion of the p-nitrophenol generated during incubation, resulting in its low determination by spectrophotometry. On the other hand, differences in results obtained by calibrating the external standard method compared to the results obtained with the standard addition method (based on adding soil samples at each point of the standard curve) can reveal the potential effects of the soil matrix on the determination of p-nitrophenol. Therefore, the objectives of this study were to i) verify the existence of a matrix effect on the final spectrophotometric quantification of p-nitrophenol, its possible magnitude, and implications for the determination of soil enzymatic activity, and ii) propose an alternative instrumental calibration methodology in cases where the matrix effect is significant. For the study, soil samples were collected from 18 locations in the Plateau and Coastal regions of the State of Paraná, from areas of native forests, agricultural fields, pasture, fallow areas post-Pinus elliottii harvest, and mangroves, with contrasting soil classes. The samples were characterized in terms of their physical and chemical parameters, and their enzymatic activities were determined based on the determination of p-nitrophenol. The p-nitrophenol values obtained from calibration curves with external standards were lower than those obtained with the standard addition method and the single-point method. Therefore, there was an indication that a matrix effect of the soil exists on the determination of p-nitrophenol, used as an analyte in the methods for determining the enzymatic activity of ß-glucosidase, arylsulfatase, and acid phosphatase. The differences were more pronounced in the activity results of ß-glucosidase in soil samples with high organic matter and clay content. The soil matrix effect was greater on the results of ß-glucosidase activity compared to the activities of arylsulfatase and acid phosphatase. This difference may be due to the combination of buffering and termination solutions for each analyzed enzyme. For situations of high clay and organic matter content in the soil, the analyses indicated that it is possible to correct the soil matrix effects on p-nitrophenol determinations using both the standard addition method and the single-point calibration method. However, because the were high correlations between the three methods, the use of external standard corroborated its use for soil healthy studies.