Desenvolvimento de um nanomaterial híbrido responsivo à temperatura para a modulação da atividade da lipase de Candida antarctica fração B (CALB)

Abstract

Resumo: O desenvolvimento de nanomateriais híbridos é uma área de pesquisa empolgante e inovadora com potencial para impactar diferentes áreas. Neste trabalho, foi desenvolvido um nanomaterial híbrido composto por nanopartículas de ouro (AuNP), a lipase de Candida antarctica fração B (CALB) e o polímero poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAm). Foram realizadas as sínteses das AuNPs e do PNIPAm, o estudo de suas propriedades e da interação entre AuNP e CALB. Inicialmente foram sintetizadas AuNPs estáveis e com tamanho aproximado de 5 nm (determinado por MET), nas quais foi imobilizada a enzima. A enzima foi inserida durante e após a síntese das AuNPs e em ambos os casos a CALB foi adsorvida na superfície, atuando como um bom agente estabilizante. Uma das preocupações ao se realizar este tipo de procedimento, é de que a imobilização leve a perda de algumas propriedades da enzima, como sua atividade catalítica. Espectroscopia de fluorescência foi empregada para estudar a estrutura tridimensional na enzima, a qual mostrou que a estrutura se manteve após a imobilização. Foram propostas duas sínteses (PNI1 e PNI2) para o PNIPAm e suas propriedades foram determinadas utilizando diversas técnicas de análise e o comportamento termorresponsivo foi estudado por DLS, espectroscopia de fluorescência e UV-Vis. Por meio da análise de turbidimetria foram determinadas as temperaturas de transição do polímero, sendo 31,5 °C (PNI1) e 33,5 °C (PNI2). O método utilizado para a elaboração dos nanomateriais híbridos (MHs) se mostrou eficiente, uma vez que a estrutura proposta foi observada nas imagens de MET. O estudo da atividade enzimática demonstrou que abaixo da temperatura de transição do polímero os MHs atuam na modulação da atividade enzimática, uma vez que a conversão obtida pelos MHs é muito menor do que da enzima em sua forma livre. Enquanto com o aumento da temperatura os MHs apresentam um comportamento similar ao da CALB livre. A investigação da atividade enzimática em uma reação com mudança de temperatura também evidenciou este aspecto dos MHs. Além disso, um aumento da termoestabilidade da CALB foi observado quando a enzima estava imobilizada em AuNPs para reações realizadas a 65 °C. Assim, os nanomateriais híbridos desenvolvidos durante este trabalho oferecem uma possibilidade para a modulação da atividade enzimática da CALB, combinando estabilidade térmica com a regulação da atividade em resposta à temperatura.

Abstract: The development of hybrid nanomaterials is an exciting and innovative area of research with the potential to impact different areas. In this work, a hybrid nanomaterial was developed composed of gold nanoparticles (AuNPs), Candida antarctica lipase fraction B (CALB) and the polymer poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAm). Syntheses of AuNPs and PNIPAm were conducted, and their properties, as well as the interaction between AuNPs and CALB, were studied. Initially, stable AuNPs with a size of approximately 5 nm (determined by TEM) were synthesized, and the Enzyme was immobilized on them. The enzyme was introduced during and after the synthesis of AuNPs and in both cases, CALB was adsorbed on the surface, acting as a good stabilizing agent. One concern in carrying out this type of procedure is that immobilization may lead to the loss of some enzyme properties, such as its catalytic activity. Fluorescence spectroscopy was employed to study the three-dimensional structure of the enzyme, revealing that the structure remained after immobilization. Two syntheses (PNI1 and PNI2) were proposed for PNIPAm, and their properties were determined using various analysis techniques. Thermoresponsive behavior was studied by DLS, fluorescence spectroscopy, and UV-Vis. Turbidimetry analysis determined the polymer's transition temperatures as 31.5 °C (PNI1) and 33.5 °C (PNI2). The method used for the fabrication of the hybrid nanomaterials (MHs) proved to be efficient, as the proposed structure was observed in the TEM images. The study of enzymatic activity revealed that below the polymer’s transition temperature, the MHs act to modulate the enzymatic activity since the conversion Obtained by the MHs is much lower than that of the free enzyme. However, with increasing temperature, MHs exhibit behavior similar to that of free CALB. The investigation of enzymatic activity in a temperature-changing reaction also highlighted this aspect of MHs. Additionally, an increase in CALB’s thermostability was observed when the enzyme was immobilized on AuNPs for reactions carried out at 65 °C. Thus, the hybrid nanomaterials developed during this work offer a possibility for modulating CALB’s enzymatic activity, combining thermal stability with activity regulation in response to temperature.