Estudo funcional e mecanismos de ação do lncRNA uc.147 em linhagens de carcinoma hepatocelular e mama

Abstract

Resumo: Câncer é um termo utilizado para descrever um conjunto de mais de 100 doenças, que têm em comum o crescimento celular descontrolado e a capacidade de migrar e invadir outros tecidos. De forma geral, os mecanismos de regulação da expressão gênica têm um importante papel no desenvolvimento e progressão do processo tumoral. Nesse contexto, uma possível nova classe de RNAs longos não codificantes, as regiões ultraconservadas transcritas (T-UCRs), tem sido associada ao processo carcinogênico. As T-UCRs são 481 regiões do genoma humano que apresentam 100% de identidade entre humanos, camundongos e ratos e também com alta taxa de conservação em outras espécies. Inicialmente, em um estudo prévio realizado pelo grupo, as 481 regiões foram estudadas no câncer de mama, e o lnc-uc.147 foi evidenciado, influenciando processos celulares como: viabilidade, apoptose e ciclo celular. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi o de investigar o papel do lncuc. 147 em outros tipos tumorais, bem como identificar por quais mecanismos esse transcrito atua e pode ser regulado. A partir de dados públicos do TCGA, foram analisados 20 tipos tumorais para verificar uma possível associação com a expressão do lnc-uc.147. A partir destas análises, foi encontrada uma associação desta região com carcinoma hepatocelular, carcinoma renal de células claras e adenocarcinoma gástrico. O carcinoma hepatocelular (CHC), um dos modelos escolhido para ser investigado neste estudo, é o subtipo de câncer de fígado mais comum, correspondendo a 75-85% dos casos. Dessa maneira, para o estudo do lnc-uc.147 em CHC foi utilizada a linhagem celular HepG2. O estudo funcional foi feito a partir do silenciamento do transcrito, e os ensaios utilizados foram viabilidade e proliferação celular, formação de colônias, ensaio de migração, apoptose e ciclo celular. Após silenciamento do lnc-uc.147, observamos uma diminuição na viabilidade celular e da capacidade de formar colônias pela linhagem HepG2. Não foram observadas diferenças na capacidade migratória, taxa de proliferação, quantidade de células mortas e dinâmica do ciclo celular destas células. Buscando o entendimento dos mecanismos moleculares de ação desse transcrito em células de câncer de mama e fígado, através de dados prévios do grupo, uma lista de proteínas que possivelmente interagem com o lncRNA foi obtida por meio do ensaio de RNA pulldown. Uma das proteínas de destaque é a KRT17, que possui importante papel no câncer de mama e também já foi estudada em câncer hepático. Dessa maneira, a interação entre a KRT17 e o lnc-uc.147 foi investigada. Adicionalmente, a expressão de genes vizinhos também foi avaliada após silenciamento do lnc-uc.147, o que pode indicar ainda mecanismos adicionais de regulação gênica desta molécula. Ainda, foi verificado que o fator de transcrição TEAD4 é capaz de regular a transcrição do lnc-uc.147. Este foi o primeiro trabalho relacionando o lnc-uc.147 ao carcinoma hepatocelular e descrevendo mecanismos de regulação e ação desse lncRNA. Nesse contexto, nossos resultados contribuem para o melhor entendimento da função das T-UCRs no câncer, podendo, no futuro, auxiliar na identificação de biomarcadores e moléculas alvo candidatas para terapia. Palavras-chave: T-UCRs; Carcinoma hepatocelular; câncer de mama; uc.147; LncRNAs.

Abstract: Cancer is a term used to describe a set of more than 100 diseases, which have in common uncontrolled cell growth and the ability to migrate and invade other tissues. In general, the mechanisms of gene expression regulation play an important role in the development and progression of the tumor process. In this context, a possible new class of long non-coding RNAs, the ultraconserved transcribed regions (T-UCRs), has been associated with the carcinogenic process. T-UCRs are 481 regions of the human genome that show 100% identity between humans, mice and rats and also have a high rate of conservation in other species. Initially, in a previous study carried out by the group, the 481 regions were studied in breast cancer, and the lnc-uc.147 was evidenced, influencing cellular processes such as: viability, apoptosis and cell cycle. Thus, the objective of the present work was to study lnc-uc.147 in other tumor types, as well as to identify the mechanisms by which this transcript acts. From TCGA public data, 20 tumor types were analyzed to verify a possible association with the expression of lnc-uc.147. From these analyses, an association of this region with hepatocellular carcinoma, clear cell renal carcinoma and gastric adenocarcinoma was found. Hepatocellular carcinoma (HCC), one of the models chosen to be investigated in this study, is the most common subtype of liver cancer, accounting for 75-85% of cases. Thus, for the study of lnc-uc.147 in HCC, the HepG2 cell line was used. The functional study was carried out by silencing the transcript, and the assays used were cell viability and proliferation, colony formation, migration, apoptosis and cell cycle assays. After silencing lnc-uc.147, we observed a decrease in cell viability and the ability to form colonies by the HepG2 cell line. No differences were observed in the migratory capacity, proliferation rate and cell cycle dynamics of these cells. Seeking to understand the molecular mechanisms of action of this transcript in liver and breast cancer cells, through previous data from the group, a list of proteins that possibly interact with lncRNA was obtained through the RNA pulldown assay. One of the prominent proteins is KRT17, which has an important role in breast cancer and has also been studied in liver cancer. In this way, the interaction between KRT17 and lncuc. 147 was investigated. Additionally, the expression of neighboring genes was also evaluated after silencing of lnc-uc.147, which may indicate additional mechanisms of gene regulation of this molecule. Furthermore, it was verified that the transcription factor TEAD4 is able to regulate the transcription of lnc-uc.147. This was the first work relating lnc-uc.147 to hepatocellular carcinoma and describing mechanisms of regulation and action of this lncRNA. In this context, our results contribute to a better understanding of the role of T-UCRs in cancer, and may, in the future, help in the identification of biomarkers and candidate target molecules for therapy. Key-words: T-UCRs; Hepatocellular carcinoma; Breast cancer; uc.147; LncRNAs.