Estudo imunocitoquímico dos componentes da membrana basal de glândula parótida de ratos

Abstract

Resumo: As membranas basais fornecem um suporte físico e também controlam as interações epitélio-mesenquimais durante o desenvolvimento dos tecidos e órgãos. Entre os componentes das membranas basais estão o colágeno tipo IV, as glicoproteínas laminina e entactina, e a proteoglicano heparam-sulfato. Estes componentes interagem entre si e com as células determinando a morfogênese tecidual, o desenvolvimento, a manutenção tecidual e a diferenciação celular. O desenvolvimento das glândulas salivares foi amplamente estudado durante os últimos anos, principalmente em relação às glândulas submandibular e sublingual, sendo que, em relação à glândula parótida, poucos trabalhos mencionam estudos relativos a seu desenvolvimento. O objetivo deste trabalho foi realizar, através de coloração com imunocitoquímica indireta, uma análise da ocorrência e distribuição de duas glicoproteínas da membrana basal - laminina (LN) e colágeno tipo IV (Col-IV) - e uma glicoproteína da matriz intersticial, que também está presente nas membranas basais subendoteliais e membranas basais embrionárias - fibronectina (FN) -, na glândula parótida (GP) de embriões de ratos do 17° ao 20° dia de gestação (DG), de ratos recém-nascidos (21° DG) e do 5o dia após nascimento (DAN). Cortes de GP nestes estágios foram previamente tratados com solução de tripsina a 0,015% e incubados na presença de anticorpos policlonais que xix reconhecem laminina, colágeno tipo IV e fibronectina. Em seguida, foram incubados com anticorpo secundário conjugado com peroxidase (LN) e anticorpo secundário biotinilado (Col-IV e FN). Estes últimos foram incubados com uma solução de streptavidina conjugada com peroxidase. Após a revelação da peroxidase com diaminobenzidina, os cortes foram contra-corados com hematoxilina de Mayer e montados em meio sintético. Cortes-controle foram incubados com soro normal de cabra, ao invés do anticorpo primário. Cortes equivalentes foram corados rotineiramente com hematoxilina e eosina (HE). Entre o 17° DG e o 20° DG, os cortes corados com HE mostraram que a GP já apresenta extenso crescimento e ramificação. A GP do 21° DG apresenta estruturas denominadas de maciços celulares, que já esboçam ácinos (pré-acinos) e duetos, indicando que já está ocorrendo a formação da organização histológica de uma GP adulta. No 5o DPN, a estrutura histológica da GP apresenta ácinos e duetos de diferentes diâmetros. Os resultados de imunoperoxidase mostraram que, em todos os dias estudados, tanto a LN quanto o Col-IV apresentavam localização semelhante, ou seja, estavam presentes na membrana basal. Entre o 17° e o 20° DG, observamos marcação intracelular na forma de pequenos grânulos, indicando que as células dos bulbos terminais da glândula parótida sintetizam estas glicoproteínas. No 21° DG e 5o DPN, a marcação estava presente ao redor dos maciços celulares (pré-ácinos), nos duetos do 21° DG e ao redor dos ácinos e duetos do 5o DPN. Nestes dias, a marcação intracelular estava ausente. Os resultados para FN demonstraram que a glicoproteína está presente no mesênquima entre o 17° e o 20° DG em uma estrutura semelhante a pequenas xx fibrilas, entre as ramificações e os bulbos terminais. No 21° DG, a FN estava presente no tecido conjuntivo frouxo. No 5o DPN, a marcação ocorre nos septos do conjuntivo que separa a glândula parótida em lóbulos. O conjunto dos resultados leva à conclusão de que as glicoproteínas (LN e Col-IV) apresentam co-expressão e co-localização na membrana basal. Com base na literatura, inferimos que estas duas glicoproteínas interagem entre si e com as células da GP em crescimento proporcionando um suporte para a diferenciação de uma estrutura acinar complexa. Além disso, as glicoproteínas podem interagir com algumas moléculas da matriz intersticial, entre elas a FN. Como o processo de ramificação glandular é direcionado pelo mesênquima, esta interação também auxilia no processo de crescimento e ramificação da glândula parótida.

Abstract: The basement membranes provide a physical support and also control the epithelio-mesenchymal interaction during tissue development and organogenesis. Among their components, they present type IV collagen (Col-IV), the glycoproteins laminin (LN) and entactin, and the heparan-sulphate proteoglycan. These components interact with one another and with the cells thus determining morphogenesis, growth and maintenance of epithelial tissues, as well as cellular differentiation. The development of the salivary gland has been the focus of many studies in recent years - particularly the basement membrane in the submandibular and sublingual glands - but there are still very few works focusing the development of the parotid gland (PG). So, the aim of the present work is to study - using a staining method with indirect immunocytochemistry - the occurrence and distribution of glycoproteins - LN and Col-IV - and an interstitial matrix glycoprotein that is also present in the subendotelial basement membranes and in the embryonic basemente membrane - fibronectin (FN) -, in the basement membrane of the rat parotid gland in three different stages: between the 17th and the 20th day of pregnancy (DP), in new born rats (21st DP) and on the 5th day after birth (DAB). At each of these points in time, the cuts were initially treated with a 0.0,15% tripsin solution and incubated in the presence of the polyclonal primary antibodies that recognize LN, Col-IV and FN. After that, the sections were incubated with the xxii secondary antibody conjugated with peroxidase - LN - and with the biotinilated secondary antibody - Col-IV and FN. The latter were incubated with a streptavidine solution conjugated with peroxidase. After developing the peroxidase with a 3.3 diaminobenzidine solution, the cuts were counterstained with Mayer hematoxylin and mounted on a synthetic medium. All control sections were incubated with normal goat serum instead of the primary antibody. Equivalent parotid gland cuts were routinely stained with hematoxylin and eosin (HE). The cuts stained with HE show that, between the 17th and the 20th DP, the parotid gland already presents extensive growth, elongation and branching. On the 21st DP, cellular dense woods are detected, showing a sketch of acini (pre-acini) and ducts, which indicate the formation of the histological organization of an adult PG. On the 5th DAB, the histological organization presents acini and ducts of different diameters. The immunocytochemical analysis shows that both LN and Col-IV present a similar location - both are detected in the basement membrane of the gland epithelium on all days studied - and this similar antigenicity indicates a possible colocation. There are spots of intracellular staining - like small granules - for LN and Col-IV between the 17th and the 20th DP, indicating active LN and Col-IV synthesis. On the 21st DP, the staining pattern is present around cellular dense woods (preacini) and ducts. On the 5th DAB, the staining is present around acini and ducts and no spots of intracellular staining are detected. The FN immunoperoxidase shows that this glycoprotein is present in the mesenchymal tissue between the 17th and the 20th DP in a structure that looks like small fibrils, between the branching and the terminal cluster. On the 21st DP, FN is xxiii present on loose connective tissue. On the 5th DAB, FN is present only in the connective tissue. These results lead to the conclusion that there is co-expression and colocation of the glycoproteins - LN and Col-IV - in the basement membrane. From the available literature it is possible to infer that these two glycoproteins interact with one another and with the parotid gland cells morphogenesis thus providing a support for the differentiation of a complex acinar structure. Furthermore, the glycoproteins can interact with other interstitial molecules, such as FN. As the epithelial branching is a consequence of the mesenchymal arrangement, this interaction also helps in the process of branching, growing and elongating of the parotid gland.