Identificação da diversidade microbiana e de genes de resistência presentes em amostras de efluentes circunvizinhos a produções suínas no Paraná, Brasil

Abstract

Resumo: Há um expressivo uso de antibióticos para manter a saúde humana e animal, seja como medida preventiva ou como potencializador dos índices zootécnicos na produção animal. Contudo, como os animais não metabolizam cerca de 70% dos antibióticos consumidos, muitas dessas substâncias são eliminadas pela urina e fezes, atingindo o meio ambiente e favorecendo a disseminação de genes de resistência a antibióticos no solo e na água. Essa dissertação teve como objetivo determinar a diversidade microbiológica e a presença de genes de resistência em amostras de água de rios, em locais próximos a produções suínas. A primeira parte desta dissertação foi realizada em cinco áreas circunvizinhas à produção suinícola industrial nas localidades de Curitiba, Piraí do Sul, Itambaracá, Palotina e Santa Mariana, no estado do Paraná, Brasil. Foi coletado 1 litro de água, em triplicata (3 L), de cada um dos cinco pontos, totalizando 15 amostras de água a montante (15 L) e 15 amostras a jusante (15 L). As amostras foram acondicionadas em isopor com gelo após a coleta e armazenadas em < 4°C até o momento do processamento laboratorial. As amostras de água de cada ponto de coleta foram agrupadas em um pool de 3 L, homogeneizadas manualmente e filtradas a vácuo em membrana filtrante de polietersulfona. As membranas foram submetidas a extração de DNA genômico utilizando o kit Wizard Magnetic DNA Promega (Madison, USA), seguindo um protocolo de extração adaptado. O metagenoma total foi sequenciado na plataforma Illumina NextSeq 2000. O perfil taxonômico das amostras foi determinado pelo programa Kraken2. Os genes para resistência presentes no metagenoma foram identificados diretamente das leituras, através de comparações com o banco de dados MEGARes (Microbial Ecology Group, USA), em conjunto com o pipeline de bioinformática AMR++ V3.0. A segunda parte desta dissertação foi realizada em onze áreas circunvizinhas à produção suinícola industrial nas localidades de Piraí do Sul, Carambeí, Palotina e Toledo. Foi coletado 1 litro de água, em triplicata (3 L), de cada um dos 11 pontos, totalizando 33 amostras de água a montante (33 L) e 33 amostras a jusante (33 L). As amostras de água de cada ponto de coleta foram preparadas individualmente (66 amostras no total) para cultivo microbiológico. Para cultivo microbiológico, as amostras foram cultivadas em seis meios seletivos, sendo previamente enriquecidas em água peptonada, homogeneizadas e incubadas a 37°C, overnight. Sequencialmente, 100 µl de cada amostra foi plaqueado em cada meio de cultura e incubado a 37°C por 24 horas. Para a análise metagenômica, as amostras foram agrupadas em dois pools, sendo um pool com os 33 L de água a montante e outro pool com os 33 L de água a jusante. O perfil taxonômico das amostras foi determinado pelo servidor de análises metagenômicas MG-Rast. Os genes para resistência presentes no metagenoma, foram identificados através de comparações com o banco de dados Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) realizada pelo software Resistance Gene Identifier (RGI) e por busca no modelo HMM Resfams pelo programa HMMer. Dentre os resultados da primeira parte, em 60% dos pontos amostrados, considerando todas as cidades amostradas, apresentaram genes de resistência aos antibióticos. Além disso, os pontos a jusante de Curitiba e Santa Mariana apresentaram genes de resistência a metais pesados e biocidas. Nos pontos a montante de Curitiba e Itambaracá não foram identificados genes capazes de codificar resistência a algum composto. Em relação à gama de genes detectados, as classes de antibióticos mais encontradas às quais esses conferem resistência foram: MacrolídeosLincosamidas-Estreptogaminas (67%), elfamicinas (19%), tetraciclinas (10%) e aminoglicosídeos (4%). Nesta parte deste trabalho, revelou-se a presença de genes de resistência que têm como alvo importantes classes de antibióticos utilizados para tratamentos em humanos e animais. Os dados apresentaram genes capazes de conferir resistência a metais pesados, como mercúrio e cobre. Esses resultados podem sugerir que a exposição a metais pesados pode desempenhar um papel na disseminação e agravamento da resistência aos antibióticos em populações bacterianas. Em relação à segunda parte dos resultados apresentados nessa dissertação, o pool das amostras de água a jusante apresentou maior prevalência do gênero Pseudomonas spp. (61,27%) quando comparado com o pool de amostras a montante (14,3%). Os demais gêneros bacterianos que também estavam mais prevalentes no pool de amostras, a montante, foram Polynucleobacter (11.6%), Leptothrix (4.5%), Curvibacter (4.3%), Polaromonas (4.2%) e Burkholderia (3.0%). Semelhante, porém com diferentes taxas de distribuição, os gêneros Polaromonas (4.0%), Curvibacter (2.8%), Burkholderia (2.1%), Acidovorax (1.6%) e Leptothrix (1.5%), predominaram no pool de amostras a jusante. O pool de amostras a jusante apresentou 14 diferentes GRAs, contra cinco encontrado a montante. Os genes soxR e AmpC, encontrados apenas a jusante, podem estar relacionados com a presença de P. aeruginosa resistente a antibióticos, como tetraciclina, cefalosporina, fluoroquinolonas e ß-lactâmicos. A presença de bactérias Pseudomonas spp. em maior prevalência, com identificação de um perfil resistente no pool de amostras a jusante, sugere a ocorrência de pressão de seleção de antibióticos, após a passagem nas granjas suínas.

Abstract: There is a significant use of antibiotics to maintain human and animal health, either as a preventive measure or as an enhancer of zootechnical indices in animal production. However, as animals do not metabolize around 70% of the antibiotics consumed, many of these substances are excreted in urine and feces, reaching the environment and favoring the spread of antibiotic-resistant genes in soil and water. This dissertation aimed to determine the microbiological diversity and the presence of resistance genes in water samples from rivers near pig farms. The first part of this dissertation was conducted in five areas near industrial pig production facilities in Curitiba, Piraí do Sul, Itambaracá, Palotina, and Santa Mariana, in the state of Paraná, Brazil. One liter of water was collected in triplicate (3 L) from each of the five points, totaling 15 upstream water samples (15 L) and 15 downstream samples (15 L). The samples were stored in an insulated container with ice after collection and kept at < 4°C until laboratory processing. The water samples from each collection point were grouped into a 3 L pool, manually homogenized, and vacuum-filtered using polyethersulfone filter membranes. The membranes underwent genomic DNA extraction using the Promega Wizard Magnetic DNA kit (Madison, USA) following an adapted extraction protocol. The total metagenome was sequenced on the Illumina NextSeq 2000 platform. The taxonomic profile of the samples was determined using the Kraken2 program. Resistance genes present in the metagenome were directly identified from the reads by comparing them with the MEGARes database (Microbial Ecology Group, USA), along with the AMR++ V3.0 bioinformatics pipeline. The second part of this dissertation was carried out in eleven areas near industrial pig production facilities in Piraí do Sul, Carambeí, Palotina, and Toledo. One liter of water was collected in triplicate (3 L) from each of the 11 points, totaling 33 upstream water samples (33 L) and 33 downstream samples (33 L). The water samples from each collection point were individually prepared (66 samples in total) for microbiological cultivation. For microbiological cultivation, the samples were cultured on six selective media, previously enriched in peptone water, homogenized, and incubated at 37°C overnight. Subsequently, 100 µl of each sample was plated on each culture medium and incubated at 37°C for 24 hours. For metagenomic analysis, the samples were grouped into two pools, one with the 33 L of upstream water and another with the 33 L of downstream water. The taxonomic profile of the samples was determined using the MG-Rast metagenomics analysis server. Resistance genes present in the metagenome were identified by comparing them with the Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) using the Resistance Gene Identifier (RGI) software and by searching the HMM Resfams model with the HMMer program. In the first part of the results, 60% of the sampled points, considering all the cities sampled, exhibited antibiotic resistance genes. Furthermore, the downstream points of Curitiba and Santa Mariana displayed resistance genes to heavy metals and biocides. No genes capable of encoding resistance to any compound were identified upstream of Curitiba and Itambaracá. Regarding the range of detected genes, the most found antibiotic classes conferring resistance were MLS (67%), elfamycins (19%), tetracyclines (10%), and aminoglycosides (4%). In this part of the study, the presence of resistance genes targeting important antibiotic classes used in human and animal treatments was revealed. The data also showed genes capable of conferring resistance to heavy metals such as mercury and copper, suggesting that exposure to heavy metals may play a role in the dissemination and exacerbation of antibiotic resistance in bacterial populations. As for the second part of the results presented in this dissertation, the downstream water sample pool had a higher prevalence of the genus Pseudomonas spp. (61.27%) compared to the upstream sample pool (14.3%). Other bacterial genera that were also more prevalent in the upstream sample pool were Polynucleobacter (11.6%), Leptothrix (4.5%), Curvibacter (4.3%), Polaromonas (4.2%), and Burkholderia (3.0%). Similarly, but with different distribution rates, the genera Polaromonas (4.0%), Curvibacter (2.8%), Burkholderia (2.1%), Acidovorax (1.6%), and Leptothrix (1.5%) predominated in the downstream sample pool. The downstream sample pool presented 14 different antibiotic resistance genes (GRAs), compared to five found in the upstream pool. The genes soxR and AmpC, found only downstream, are related to the presence of antibiotic-resistant P. aeruginosa, including resistance to tetracycline, cephalosporin, fluoroquinolones, and ß-lactams. The prevalence of Pseudomonas spp. in the downstream sample pool, along with the identification of a resistant profile, suggests the occurrence of antibiotic selection pressure after passing through pig farms.