Aspectos estruturais, bioquímicos e biológicos de fosfolipases-D de aranhas-marrom (gênero Loxosceles)

Abstract

Resumo: O loxoscelismo é o conjunto de manifestações clínicas decorrente do envenenamento causado pela picada por aranhas do gênero Loxosceles, popularmente conhecidas como aranhas-marrom. No Brasil, mais de 29.000 casos foram notificados entre os anos de 2019 a 2022, sendo L. intermedia, L. gaucho e L. laeta as espécies responsáveis pela maior quantidade de casos, principalmente nas regiões sul e sudeste do país. Dentre as toxinas do veneno dessas aranhas, as principais e mais estudadas são as fosfolipases-D (FLDs), pois reproduzem a maioria dos sintomas do loxoscelismo. Estudos anteriores identificaram e produziram as isoformas recombinantes de FLDs mais expressas em cada uma das espécies de aranhamarrom supracitadas. Diante disso, este trabalho visou produzir essas toxinas (LiRecDT1, LgRecDT1 e LlRecDT1), e comparar suas atividades bioquímicas e biológicas experimentalmente. Após produção em sistema de expressão procarioto e purificação por cromatografia de afinidade, as toxinas foram submetidas a uma bateria de ensaios. As sequências de aminoácidos das proteínas foram analisadas por alinhamento múltiplo, que mostrou, principalmente, a conservação total dos aminoácidos envolvidos na atividade catalítica dessas enzimas. Posteriormente, foram realizados ensaios de Western-Blotting e ELISA, nos quais foi possível verificar a ocorrência de reatividade antigênica cruzada entre as três diferentes FLDs. Verificou-se também que o soro contra LgRecDT1 se mostrou mais reativo frente às outras FLDs em comparação as demais isoformas. Alternativamente, foi conduzido um ensaio fluorimétrico denominado Amplex RedTM para avaliar as atividades catalíticas das enzimas utilizando dois substratos que são encontrados na superfície das membranas celulares; esfingomielina e lisofosfatidilcolina. Os resultados indicaram que existe diferença na velocidade de degradação desses substratos com as diferentes FLDs, e que, para ambos os substratos, a intensidade da atividade catalítica foi superior para LgRecDT1 e inferior para LiRecDT1, com LlRecDT1 apresentando valores intermediários. O ensaio também sugeriu que as toxinas têm maior atividade catalítica quando são incubadas com esfingomielina. Além disso, foram avaliadas as atividades dessas enzimas in vivo em camundongos. O edema de pata mostrou que todas as toxinas foram capazes de induzir edema, sendo LlRecDT1 a mais edematogênica, seguido de LgRecDT1. Embora LiRecDT1 também tenha demonstrado formação de edema, foram necessárias doses superiores para desempenhar resultados semelhantes as demais. O ensaio de letalidade demonstrou que a mortalidade induzida por LgRecDT1 é superior. LiRecDT1 apresentou menor letalidade dentre as três. Também foi avaliada a atividade inseticida das FLDs recombinantes, usando grilos como modelo animal. Os resultados mostraram que, após 24 horas, LlRecDT1 e LgRecDT1 têm o maior potencial letal/paralisante quando comparadas com LiRecDT1. Após o final do experimento nenhum grilo sobreviveu, destacando a letalidade dessas toxinas em insetos. De forma geral, os resultados mostraram que, apesar da alta similaridade, as FLDs dos venenos de L. gaucho e L. laeta são mais ativas que a de L. intermedia. Os estudos que foram realizados neste trabalho contribuirão para o entendimento do mecanismo de ação dessas enzimas, e para esclarecer as diferenças entre venenos de espécies diferentes.

Abstract: Loxoscelism is the set of clinical manifestations resulting from the envenomation caused by the bite of spiders of the Loxosceles genus, commonly known as brown recluse spiders. In Brazil, over 29,000 cases were reported between 2019 and 2022, with L. intermedia, L. gaucho, and L. laeta, which are responsible for the majority of cases, particularly in the southern and southeastern regions of the country. Among the toxins in the venom of these spiders, the main and most studied ones are phospholipases-D (FLDs), as they reproduce most of the signs and symptoms of loxoscelism. Previous studies identified and produced recombinant isoforms of FLDs that are most expressed in each of the aforementioned species. In light of this, this work aimed to produce these toxins (LiRecDT1, LgRecDT1, and LlRecDT1) and compare their biochemical and biological activities. After production in a prokaryotic expression system and purification by affinity chromatography, the toxins underwent a battery of assays. Protein amino acid sequences were analyzed through multiple alignments, showing the overall conservation of amino acids involved in the catalytic activity of these enzymes. Subsequent Western Blotting and ELISA assays revealed cross-reactivity between the three different FLDs. It was also observed that the serum against LgRecDT1 showed greater reactivity against the other FLDs compared to the other isoforms. Alternatively, a fluorimetric assay called Amplex RedTM was conducted to evaluate the catalytic activities of the enzymes using two substrates found on the surface of cell membranes: sphingomyelin and lysophosphatidylcholine. Results indicated differences in the degradation rate of these substrates, with LgRecDT1 showing higher catalytic activity for both substrates, LiRecDT1 showing lower activity, and LlRecDT1 presenting intermediate values. The assay also suggested that the toxins have greater catalytic activity when incubated with sphingomyelin. Additionally, in vivo activities of these enzymes were evaluated in mice. Paw edema assay showed that all toxins induced edema, with LlRecDT1 being the most edematogenic, followed by LgRecDT1. Although LiRecDT1 also demonstrated edema formation, higher doses were required to achieve similar results to the other isoforms. Lethality assays demonstrated higher mortality induced by LgRecDT1, with LiRecDT1 showing the lowest lethality among the three. Insecticidal activity of recombinant FLDs was also assessed using crickets as a model. Results showed that, after 24 hours, LlRecDT1 and LgRecDT1 had the highest lethal/paralytic potential compared to LiRecDT1, and no crickets survived at the end of the experiment, highlighting the lethality of these toxins in insects. Overall, the results demonstrated that, despite high similarity, FLDs from the venoms of L. gaucho and L. laeta are more active than those of L. intermedia. The studies conducted in this work will contribute to understand the mechanism of action of these enzymes and to clarify the differences between venoms of different species.