Mecanismos moleculares implicados na fisiopatogênese do tumor de córtex adrenal de crianças

Abstract

Resumo: O tumor adrenocortical em crianças (TAC) é uma neoplasia rara e sua incidência é cerca de 10 a 15 vezes maior nos estados de São Paulo e Paraná que em qualquer outro lugar do mundo. Nessa região brasileira, os TACs se encontram, em sua grande maioria, associados à mutação na linhagem germinativa do gene TP53 (R337H). O sintoma mais comum dessa neoplasia é síndrome virilizante, devido à produção tumoral de esteróides androgênicos, que pode estar associada ou não a um excesso de glicocorticóide. A grande maioria dos pacientes com TAC é diagnosticada até os três anos de idade, porém os responsáveis pelas crianças relatam que, normalmente, os sintomas começaram a surgir de 3 meses a 1 ano antes do diagnóstico. Diante dessas observações e de uma série de diferenças entre tumores de crianças e de adultos, existe a hipótese de que o tumor de crianças poderia surgir durante o período embrionário. Uma das evidências que sustenta essa hipótese é a presença do marcador embrionário fosfatase alcalina placentária (PLAP/PLAP-símile) em amostras de TACs. Com base na distribuição etária dos TACs, no padrão de secreção hormonal e seu fenótipo molecular, acredita-se que esse tumor derive da zona fetal da adrenal. As glândulas adrenal e gonadal derivam do mesmo primórdio embrionário e muitos reguladores transcricionais exercem um papel importante na gênese desses dois órgãos. O fator esteroidogênico-1 (Ad4BPÁS77- /, NR5A1) é um receptor nuclear de especial importância nos TACs devido ao fato de estar amplificado e em quantidades elevadas em quase a totalidade dos TACs brasileiros já estudados. No presente trabalho verificou-se que dentre as nove (9/16) amostras de TC A com aumento na atividade enzimática de PLAP/PLAP-símile, verificou-se que seis (75%) apresentaram concomitante aumento na expressão de SF-1 e para uma amostra esse dado não estava disponível. Infelizmente, ainda não foi estabelecida linhagem celular derivadas dos TACs e apresentando a mutação R337H do TP53. Para verificar as consequências celulares e moleculares do aumento de SF-1 nas células adrenocorticais, foram construídos clones expressando a proteína SF-1 normal e mutante [S203A, L451A/L452A (AF-2mut) e A433W] de forma induzida por doxiciclina em células da linhagem de carcinoma adrenocortical H295R. A atividade de transativação de SF-1 é necessária para a promoção dos efeitos de SF-1, uma vez que os dois mutantes AF-2 não foram capazes de induzir a proliferação. Os clones mutantes S203A e A433W foram parcialmente capazes de estimular a proliferação sob indução por doxiciclina. Com o objetivo de verificar como a modulação dos níveis endógenos de SF-1 influencia na proliferação das células H295R, essas foram transfectadas por dois diferentes RNAs interferentes pequenos (siRNAs) específicos para SF-1 e com siRNA controle. Verificou-se que ambos siRNA anti-SF-1 reduziram significativamente a expressão de SF-1, promovendo uma redução da proliferação celular e um aumento da taxa de células apoptóticas. O presente estudo demonstra a grande importância da dosagem de SF-1 na tumorigênese adrenocortical, justificando assim, o desenvolvimento de drogas contra a atividade transcricional de SF-1 para a terapia de TAC.

Abstract: Adrenocortical tumor is a rare neoplasia in children (ACT) and its incidence is about 10-15 times higher in the states of São Paulo and Paraná that in any other place of the world. In this Brazilian region, the ACTs are found, in its great majority, associated to the germ line TP53 R337H mutation. The most common clinical manifestation of this neoplasm is a virilizing syndrome, due to tumoral production of steroidal androgens, that can be associated or not to a glucocorticoid excess. The great majority of the patients with ACT in southern Brazil is diagnosed before three years of age, however the children's guardians refer that usually the symptoms had started to appear about six months - two years before diagnosis. Because of these clinical data and a series of differences between children and adults tumors, the hypothesis has been formulated that children's ACT may first arise during the embryonic period. One of the evidences that support this hypothesis is the expression of the embryonic marker placental alkaline phosphatase (PLAP/PLAP-like) in ACT samples. On the basis of the ACTs age distribution, the pattern of hormonal secretion and the molecular phenotype, we suppose that this tumor derives from the fetal zone of the adrenal cortex. The adrenal and gonadal glands derive from the same embryonic primordium and many transcription regulators have great importance in the genesis of these two organs. Steroidogenic Factor-1 (Ad4BP/SF-l; NR5A1) is a nuclear receptor of special importance in the ACTs, because it is amplified and overexpressed in almost all studied Brazilian ACTs. In the present study we report that nine of sixteen studied (9/16) ACT had increased PLAP/PLAP-like enzymatic activity. Six of them (75%) have concomitant increase in SF-1 expression and for one sample data were not available. Unfortunately, cell lines derived from childhood ACTs and bearing the TP53 R337H mutation are lacking. Consequently, to dissect the cellular and molecular consequences of increased levels of SF-1 in human adrenal cells we overexpressed wild-type and mutant [S203A, A433W and L451A/L452A (AF-2mut)] SF-1 proteins in an inducible fashion in the H295R adrenal cell line. AF-2 - dependent transactivation activity of SF-1 is necessary to activate proliferation. S203A and A433W mutants were still partially able to activate proliferation in a doxycycline-dependent manner when overexpressed in H295R cells. With the objective to verify if the modulation of the endogenous levels of SF-1 influences the proliferation of H295R cells, these were transfected with two different short interfering RNA (siRNAs) specific for SF-1 and with a siRNA control. It was verified that both anti-SF-1 siRNAs significantly decrease SF-1 expression, inhibit proliferation and increase apoptosis. The present study demonstrates the pivotal importance of SF-1 dosage in adrenocortical tumorigenesis, thus justifying the development of drugs against the transcriptional activity of SF-1 for ACT therapy.