Enriquecimento de vesículas extracelulares de Giardia intestinalis por centrifugação diferencial e por gradiente de sacarose

Abstract

Resumo: Giardia intestinalis é um protozoário flagelado, causador da doença diarreica denominada giardíase. Recentemente a produção de vesículas extracelulares (VEs) por G. intestinalis e o papel dessas VEs na interação do parasito com o hospedeiro foi descrito. De acordo com a biogênese, as VEs são agrupadas em grandes (na sua maioria microvesículas) e pequenas (majoritariamente exossomos) e os dois grupos foram descritos em G. Intestinalis. As populações de VEs são heterogêneas e métodos aprimorados para separá-los e estudá-los são necessários para entender seus papéis na fisiologia e na patologia. Este trabalho objetivou-se em enriquecer e caracterizar as VEs de G. intestinalis, visando compreender melhor os papéis dessas vesículas na interação do parasito com o hospedeiro. Para isso, estabelecemos um método para enriquecer as VEs e as caracterizamos com base no tamanho por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). A produção de VEs foi induzida incubando G. intestinalis em meio TYI-S-33 sem soro, com 1mM de CaCl2, por 1h a 37º C. As VEs foram isoladas do sobrenadante por centrifugação diferencial a 15K por 1 hora e 4 horas e pela ultracentrifugação diferencial a 100K por 1 hora e 30 minutos. Também as VEs foram isoladas por centrifugação diferencial a 15K 4h e separadas em frações por gradiente de sacarose. Como principal resultado, o NTA mostrou que a ultracentrifugação direta a 100K 1,5h e a 15K 4h concentraram mais VEs (177,6x108/ml e 165,4x108/ml, respectivamente) em comparação com a centrifugação a 15K 1h (93,2x108/ml) e dessas VEs a maioria eram médias (mVEs) e grandes (lEVs). Quanto ao gradiente de sacarose, a fração 6 concentrou mais partículas (148,8x108/ml) e eram na sua maioria VEs grandes (lEVs). Vimos que os VEs liberados por G. intestinalis podem ser melhor enriquecidas por ultracentrifugação a 100K 1,5h, ou por centrifugação 15K 4h. Este último pode ser feito utilizando uma centrífuga de bancada, o que pode ser útil para pesquisadores que desejam investigar o papel das VEs, mas não possuem uma ultracentrífuga. Espera-se que este trabalho possa auxiliar no estudo de VEs.Giardia intestinalis é um protozoário flagelado, causador da doença diarreica denominada giardíase. Recentemente a produção de vesículas extracelulares (VEs) por G. intestinalis e o papel dessas VEs na interação do parasito com o hospedeiro foi descrito. De acordo com a biogênese, as VEs são agrupadas em grandes (na sua maioria microvesículas) e pequenas (majoritariamente exossomos) e os dois grupos foram descritos em G. Intestinalis. As populações de VEs são heterogêneas e métodos aprimorados para separá-los e estudá-los são necessários para entender seus papéis na fisiologia e na patologia. Este trabalho objetivou-se em enriquecer e caracterizar as VEs de G. intestinalis, visando compreender melhor os papéis dessas vesículas na interação do parasito com o hospedeiro. Para isso, estabelecemos um método para enriquecer as VEs e as caracterizamos com base no tamanho por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). A produção de VEs foi induzida incubando G. intestinalis em meio TYI-S-33 sem soro, com 1mM de CaCl2, por 1h a 37º C. As VEs foram isoladas do sobrenadante por centrifugação diferencial a 15K por 1 hora e 4 horas e pela ultracentrifugação diferencial a 100K por 1 hora e 30 minutos. Também as VEs foram isoladas por centrifugação diferencial a 15K 4h e separadas em frações por gradiente de sacarose. Como principal resultado, o NTA mostrou que a ultracentrifugação direta a 100K 1,5h e a 15K 4h concentraram mais VEs (177,6x108/ml e 165,4x108/ml, respectivamente) em comparação com a centrifugação a 15K 1h (93,2x108/ml) e dessas VEs a maioria eram médias (mVEs) e grandes (lEVs). Quanto ao gradiente de sacarose, a fração 6 concentrou mais partículas (148,8x108/ml) e eram na sua maioria VEs grandes (lEVs). Vimos que os VEs liberados por G. intestinalis podem ser melhor enriquecidas por ultracentrifugação a 100K 1,5h, ou por centrifugação 15K 4h. Este último pode ser feito utilizando uma centrífuga de bancada, o que pode ser útil para pesquisadores que desejam investigar o papel das VEs, mas não possuem uma ultracentrífuga. Espera-se que este trabalho possa auxiliar no estudo de VEs.

Abstract: Giardia intestinalis is a flagellated protozoan that colonizes the small intestine causing the diarrheal disease called giardiasis. Recently, the production of extracellular vesicles (EVs) by G. intestinalis and the role of these EVs in the interaction between the parasite and the host was described. According to biogenesis, EVs are grouped into large (mostly microvesicles) and small (mostly exosomes) and both groups have been described in G. intestinalis. EVs populations are heterogeneous and improved methods to separate and study them are needed to understand their roles in physiology and pathology. This work aimed to enrich and characterize the EVs of G. intestinalis, aiming to better understand the roles of these vesicles in the interaction between the parasite and the host. To this end, we established a method to enrich EVs and characterized them based on size by nanoparticle tracking analysis (NTA). EV production was induced by incubating G. intestinalis in serum-free TYI-S-33 medium, with 1mM CaCl2, for 1h at 37º C. EVs were isolated from the supernatant by differential centrifugation at 15K for 1 hour and 4 hours and by differential ultracentrifugation at 100K 1,5h. EVs were also isolated by differential centrifugation at 15K for 4h and separated into fractions by sucrose gradient. As a main result, the NTA showed that direct ultracentrifugation at 100K 1.5h and 15K 4h concentrated more EVs (177.6x108/ml and 165.4x108/ml, respectively) compared to centrifugation at 15K 1h (93.2x108/ml) and of these VEs the majority were medium (mVEs) and large (lEVs). As for the sucrose gradient, fraction 6 concentrated more particles (148,8x108/ml) and they were mostly large EVs (lEVs). We saw that EVs released by G. intestinalis can be enriched by direct ultracentrifugation at 100K 1,5h or by centrifugation at 15K 4h. The latter can be done using a benchtop centrifuge, which could be useful for researchers who want to investigate the role of EVs but do not have an ultracentrifuge. It is hoped that this work can assist in the study of EVs.