Perfil de expressão dos transcritos de fosfolipases-D nas glândulas de veneno de aranhas Loxosceles

Abstract

Resumo: Acidentes envolvendo aranhas-marrom na América do Sul não devem ser negligenciados. No Brasil, Loxosceles intermedia, Loxosceles gaucho e Loxosceles laeta são as três espécies clinicamente relevantes, e se dispersaram no Paraná, onde causam a maioria dos casos de envenenamento. A composição do veneno dessas aranhas é complexa, e a diversidade de componentes do veneno age sinergicamente causando uma condição de evolução clínica chamada loxoscelismo. Dentre as toxinas encontradas no veneno, a família das fosfolipases-D desempenha um papel crucial na manifestação do loxoscelismo, e sozinhas reproduzem os principais efeitos observados na patologia, como dermonecrose, resposta inflamatória massiva, hemólise intravascular, anemia hemolítica e insuficiência renal. As fosfolipases-D são proteínas altamente conservadas em diferentes espécies do gênero, e um grande número de isoformas é expresso nos venenos. Devido a essas atividades biológicas, as fosfolipases-D são um alvo em potencial para o estudo do loxoscelismo e compreensão da dinâmica envolvida no envenenamento. Apesar das isoformas já bem caracterizadas, é provável que ainda existam isoformas não descritas, devido à variação no perfil de expressão desses animais de acordo com diferentes fatores. O avanço de técnicas de sequenciamento de alto rendimento tornou viável a identificação de transcritos expressos em baixos níveis, e permite um panorama amplo para a análise transcriptômica. Para identificar potenciais novas isoformas de fosfolipases-D expressas pelas glândulas de veneno de L. intermedia, L. laeta e L. gaucho, bibliotecas de RNA-seq foram construídas usando sequenciamento de nova geração (NGS) by Nextseq1000 (Illumina). Os dados obtidos pelos sequenciamentos foram processados para montagem de sequências finais, utilizando metodologia de novo contra dados de transcriptômica disponíveis na literatura como referência. Possíveis homólogos positivos para fosfolipases-D foram retidos para as análises posteriores. Com as sequências nucleotídicas desses transcritos, e com dados recuperados de banco de dados, foi inferida a árvore filogenética do gene na família Sicariidae. Essas sequências nucleotídicas originaram sequências proteicas preditas, e os resultados foram comparados às proteínas já descritas no UniProtKB. Os resultados permitiram a identificação de transcritos capazes de codificar fosfolipases- D não descritos para a espécie até agora. A topologia da árvore filogenética mostra que a evolução do gene difere da clássica filogenia para Sicariidae, e reforça hipóteses de homologia das sequências entre espécies diferentes. Esses dados serão essenciais para identificar diferenças estruturais e funcionais entre proteínas da mesma família, e podem servir de base para futuros estudos que visem avaliar biologicamente essas enzimas. A descrição de novas isoformas para a espécie pode explicar a imunogenicidade cruzada entre venenos de espécies diferentes e fundamentar a comparação toxicológica direta entre os venenos. Os resultados poderão contribuir para a construção do conhecimento completo frente ao mecanismo de ação das fosfolipases-D e estabelecer uma relação evolutiva entre os genes codificantes de fosfolipases-D.

Abstract: Accidents involving brown spiders in South America should not be neglected. In Brazil, L. laeta, L. gaucho and L. intermedia are the three clinically relevant species found in Paraná, where they are involved with accidents. The composition of the venom of these spiders is complex, and the diversity of venom components act synergistically, causing a clinically condition called loxoscelism. Among the toxins, the phospholipase-D family plays a crucial role in the clinical manifestations, and isolated can reproduce the main effects observed in the pathology, such dermonecrosis, massive inflammatory response, intravascular hemolysis, hemolytic anemia, and renal failure. Phospholipases-D are highly conserved proteins in different species of the genus, and a wide range of isoforms are expressed. Due to this importance, the phospholipases D are an important target for studying loxoscelism and understanding the dynamics involved during envenoming. Despite the isoforms reported, it is possible that there are sequences that have not been described at now, due to the variation in the expression profile of these animals according to different factors. The advance of high-throughput sequencing techniques has enabled the identification of transcripts expressed at low levels and allows a broad view for transcriptomic analysis. To identify potential new phospholipase- D isoforms expressed by the venom glands of Loxosceles intermedia, L. gaucho and L. laeta, RNA-seq libraries were constructed using next-generation sequencing (NGS) by Nextseq1000 (Illumina). The raw reads were processed to assemble the final contigs using de novo methodology against transcriptomic literature data for the genus Loxosceles as a reference. Putative homologues for phospholipases D were retained for further analysis. Using the nucleotide sequences of these transcripts, and available database, the phylogenetic tree of the gene in the Sicariidae family was inferred. These sequences had putative protein sequences predicted, and the results were compared to proteins described for the species in UniProtKB. Analysis of the results made it possible to identify transcripts encoding phospholipases-D that have not been described for the species until now. The topology of the phylogenetic tree demonstrates that gene evolution differs from the classic phylogeny for Sicariidae and reinforces hypotheses from sequence homology between different species. These data will be essential to identify structural and functional differences among phospholipases-D from the same family and can serve as a basis for future studies that aim to biologically evaluate these enzymes. The description of new isoforms for the species can explain the cross-immunogenicity between venoms from different species and a direct toxicological comparison between the venoms. The results may contribute to the construction of complete knowledge regarding the mechanism of action of phospholipases-D and establish an evolutionary relationship between the genes encoding these molecules.