Parâmetros andrológicos e criopreservação de sêmen em onça-parda (Puma concolor - Linnaeus, 1771) e jaguarundi (Puma yagouaroundi - É. Geoffroy Saint-Hilaire, 1803)

Abstract

Resumo: A onça-parda (Puma concolor) e o jaguarundi (Puma yagouaroundi) são felídeos com ampla distribuição geográfica e considerados vulneráveis em território brasileiro. Estas espécies carecem de estudos sobre sua biologia reprodutiva e reprodução assistida, sobretudo com amostragens em populações pouco estudadas. Diante disso, o presente estudo teve os seguintes objetivos: i) avaliar um protocolo de coleta de sêmen via cateterização uretral em jaguarundi; ii) descrever o microbioma seminal e uretral de jaguarundi; iii) comparar quatro extensores para criopreservação de sêmen em ambas as espécies; iv) padronizar protocolos de ensaio cometa para avaliação de danos ao DNA em ambas as espécies; v) descrever a morfometria espermática seminal de onça-parda e jaguarundi. Machos de jaguarundi (n=8) e onça-parda (n=2) alojados na Associação Mata Ciliar, Jundiaí, Brasil foram anestesiados, via intramuscular, com 0,005 mg/kg de dexmedetomidina (Dexdomitor®, Zoetis, Campinas, Brasil) associada a 10 mg/kg de cetamina (Quetamina®, Vetnil, São José dos Campos, Brasil) e foram obtidas amostras de sêmen via cateterização uretral ou eletroejaculação. Foram usados delineamentos diferentes de acordo com cada objetivo estudado. Em jaguarundi, antes de uma coleta foi realizada lavagem uretral com solução salina (0,9% NaCl) que foi utilizada junto às amostras de sêmen para cultivo e identificação do microbioma de bactérias e fungos, utilizando abordagem metagenômica e sequenciamento de nova geração. O sêmen foi refrigerado em um equipamento elétrico ou em uma caixa térmica (BotuBOX®) e, em seguida, congelado com os extensores BotuBOV®, BotuCRIO®, BotuDOG® (produtos fornecidos pela Botupharma, Botucatu, Brasil) e UEM Cat (Universidade Estadual de Maringá, Umuarama, Brasil) todos com 4% de glicerol. Os resultados demonstraram que a técnica de cateterização uretral foi eficaz na obtenção de sêmen em jaguarundi, entretanto, foi inferior à eletroejaculação. Foi descrita a morfometria espermática seminal de jaguarundi e onça-parda. A BotuBOX® pode ser utilizada como refrigerador de forma eficiente na criopreservação de sêmen, sendo que entre os extensores avaliados, o BotuBOV® preservou maior número de células viáveis e móveis que o BotuCRIO® e UEM Cat em ambas as espécies. Na onça-parda, o meio BotuDOG® apresentou resultados iguais ao BotuBOV®. A partir do sêmen fresco e pós-descongelamento foram padronizados protocolos eficazes do ensaio cometa para a avaliação de danos no DNA nas espécies, sendo demonstrados os níveis basais de danos na molécula de DNA (tail intensity) em jaguarundi (23,68 ± 9,37) e onça-parda (24,43 ± 15,80). O microbioma fúngico e bacteriano presente na uretra e sêmen de jaguarundi foi caracterizado pela primeira vez, revelando uma grande diversidade de espécies principalmente representantes dos filos Ascomycota, Proteobacteria e Firmicutes. A análise do microbioma fúngico e a diversidade observada em jaguarundis alerta para a importância de avaliar quais espécies estão presentes nos animais e suas influências sobre a homeostase urogenital. A presença de um microbioma exclusivo da uretra foi apresentada, evidenciando a necessidade de se analisar as espécies que residem nas diferentes partes do sistema urogenital, a fim de compreender como as complexas interações que podem ocorrer em cada um deles afetam a qualidade seminal. Por fim, este estudo apresentou dados sobre extensores potenciais para a criopreservação de sêmen e novas abordagens sobre a avaliação da qualidade seminal e constituintes microbianos no gênero Puma.

Abstract: The puma (Puma concolor) and the jaguarundi (Puma yagouaroundi) are felids with wide geographic distribution and considered vulnerable in Brazil. These species lack studies on their reproductive biology and assisted reproduction, especially with samplings in poorly studied populations. Therefore, the present study had the following objectives: i) to evaluate a semen collection protocol via urethral catheterization in jaguarundi; ii) describe the seminal and urethral microbiome of jaguarundi; iii) to compare four extenders for semen cryopreservation in both species; iv) standardize comet assay protocols for DNA damage assessment in both species; v) describe the seminal sperm morphometry of puma and jaguarundi. Jaguarundi (n=8) and puma (n=2) males housed at Mata Ciliar Association, Jundiaí, Brazil were IM anesthetized with 0.005 mg/kg of dexmedetomidine (Dexdomitor®, Zoetis, Campinas, Brazil) associated with 10 mg/kg of ketamine (Quetamina®, Vetnil, São José dos Campos, Brazil) and semen samples were obtained via urethral catheterization or electroejaculation. Different designs were used according to each objective studied. In jaguarundi, before collection, urethral lavage with saline solution (0.9% NaCl) was performed, which was used with the semen samples for cultivation and identification of the microbiome of bacteria and fungi, using a metagenomic approach and next-generation sequencing. The semen was cooled in electrical equipment or in a thermal box (BotuBOX®) and then frozen with the extenders BotuBOV®, BotuCRIO®, BotuDOG® (products supplied by Botupharma, Botucatu, Brazil) and UEM Cat (Universidade Estadual de Maringá, Umuarama, Brazil) all with 4% glycerol. The results showed that the urethral catheterization technique was effective in obtaining semen in jaguarundi, however, it was inferior to electroejaculation. The seminal sperm morphometry of jaguarundi and puma was described. BotuBOX® can be used as a refrigerator efficiently in semen cryopreservation, and among the evaluated extenders, BotuBOV® preserved a greater number of viable and mobile cells than BotuCRIO® and UEM Cat in both species. In the puma, the BotuDOG® medium presented the same results as the BotuBOV®. From fresh and post-thawed semen, effective protocols of the comet assay were standardized for the assessment of DNA damage in the species, demonstrating the baseline levels of DNA damage (tail intensity) in jaguarundi (23.68 ± 9.37) and puma (24.43 ± 15.80). The fungal and bacterial microbiome present in the urethra and semen of jaguarundi was characterized for the first time, revealing a great diversity of species, mainly representatives of the phyla Ascomycota, Proteobacteria and Firmicutes. The analysis of the fungal microbiome and the diversity observed in jaguarundis highlights the importance of evaluating which species are present in the animals and their influence on urogenital homeostasis. The presence of a unique microbiome of the urethra was presented, highlighting the need to analyze the species that reside in different parts of the urogenital system, in order to understand how the complex interactions that can occur in each of them affect seminal quality. Finally, this study presented data on potential extenders for semen cryopreservation and new approaches on the assessment of seminal quality and microbial constituents in the Puma genus.