Desenvolvimento de nanopartículas teranósticas de prata estabilizadas com quitosana tiolada : uma abordagem para a leishmaniose

Abstract

Resumo: A leishmaniose visceral faz parte da lista da Organização Mundial de Saúde (OMS) de seis doenças endêmicas prioritárias no mundo. O tratamento desta doença apresenta alta toxicidade e baixa adesão pelos pacientes, já o diagnóstico é realizado pela identificação dos parasitas ou por exames moleculares. Os testes imunológicos têm sido desenvolvidos para facilitar e acelerar a identificação, principalmente devido à rápida evolução da doença. Neste sentido, nanopartículas metálicas têm sido exploradas como sondas para detectar analitos. Embora suas propriedades ópticas sejam excelentes, estas partículas podem se aglomerar, o que poderia ser evitado com o capeamento com biopolímeros, aumentando sua estabilidade e possibilitando seu uso como parte de biossensores. A quitosana, uma macromolécula semissintética, se destaca na área de liberação de substâncias ativas e como agente estabilizador de nanopartículas metálicas. A introdução de grupos sulfidrila na quitosana leva à formação de ligações dissulfeto, que apresentam boa capacidade de ligação com partículas metálicas. A quitosana já é estudada como agente estabilizante de nanopartículas de prata para detecção de analitos, porém, a quitosana tiolada (TCh) ainda não é bem descrita neste campo. Portanto, o objetivo deste trabalho foi utilizar a TCh para estabilizar nanopartículas de prata (AgNPs) e depositar anticorpos na sua superfície, e dessa forma desenvolver nanoestruturas que sejam capazes de diagnosticar e tratar simultaneamente a leishmaniose. Para isso, a TCh foi sintetizada a partir do acoplamento do ácido-3-mercaptopropiônico com a quitosana, em uma reação mediada por hidrocloreto de N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida/Nhidroxissuccinimida (EDC/NHS) e posteriormente caracterizada por ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono (RMN 1H e 13C) e espectroscopia vibracional na região do infravermelho (FTIR). Além disso, a presença dos grupamentos sulfidrilas na estrutura do polímero foi confirmada pelo Ensaio de Ellman. A estabilização das nanopartículas de prata com TCh (TCh-AgNPs) foi realizada pelo método de redução química com borohidreto de sódio. As AgNPs apresentaram diâmetro médio de 29 ± 2 nm e comprimento de onda do máximo de absorção (Lambda max) médio de 391 ± 2 nm, já as TCh-AgNPs apresentaram diâmetro médio de 66 ± 1 nm e Lambda max médio de 418 ± 2 nm. Após o desenvolvimento e caracterização das TCh- AgNPs, anticorpos anti-rK39 foram ligados à superfície das nanopartículas (TCh- AgNPs@Ac) em uma reação mediada por EDC/NHS. Essas partículas formadas foram avaliadas em relação ao seu potencial imunodiagnóstico. Um biossensor baseado na técnica de ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi construído através da ligação covalente da proteína rK39 sobre o substrato de ouro previamente funcionalizado, e foi observado o potencial de ligação da rK39 com as TCh- AgNPs@Ac e com o anticorpo livre. A partir desse estudo foi observado o favorecimento da cinética da reação e maior detectabilidade pelas TCh-AgNPs@Ac. Adicionalmente, as TCh-AgNPs e as TCh-AgNPs@Ac foram testadas contra formas promastigotas de Leishmania, as quais obtiveram uma taxa de mortalidade de 79,02 ± 3,5% e 87,66 ± 13,5%, respectivamente, o que indica uma boa ação leishmanicida. Testes de segurança também foram realizados, como a avaliação da citotoxicidade em macrófagos e o ensaio cometa em linfócitos. Com os dados obtidos, as partículas demonstraram alto potencial de diagnóstico, e boa atividade leishmanicida

Abstract: Visceral leishmaniasis is part of the World Health Organization's (WHO) list of six priority endemic diseases worldwide. The treatment of this disease is highly toxic and has low patient adherence, while diagnosis is performed through the identification of parasites or molecular tests. Immunological tests have been developed to facilitate and accelerate the identification, primarily due to the rapid progression of the disease. In this regard, metallic nanoparticles have been explored as probes to detect analytes. Although their optical properties are excellent, these particles can aggregate, which could be prevented by capping them with biopolymers, increasing their stability and enabling their use as part of biosensors. Chitosan, a semi-synthetic macromolecule, stands out in the field of active substance release and as a stabilizing agent for metallic nanoparticles. The introduction of thiol groups into chitosan leads to the formation of disulfide bonds, which have a good binding capacity with metallic particles. Chitosan is already studied as a stabilizing agent for silver nanoparticles for analyte detection, but thiolated chitosan (TCh) is not well described in this field. Therefore, the aim of this work was to use TCh to stabilize silver nanoparticles (AgNPs) and deposit antibodies on their surface, thereby developing nanostructures capable of of simultaneously diagnosing and treating leishmaniasis. To pursue this, TCh was synthesized by coupling 3-mercaptopropionic acid with chitosan in a reaction mediated by N-(3- dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide/N-hydroxysuccinimide (EDC/NHS) hydrochloride, and subsequently characterized by hydrogen and carbon nuclear magnetic resonance (1H and 13C NMR) and vibrational spectroscopy in the infrared region (FTIR). In addition, the presence of thiol groups in the polymer structure was confirmed by Ellman’s assay. The stabilization of silver nanoparticles with TCh (TCh- AgNPs) was carried out by the chemical reduction method using sodium borohydride. The AgNPs had an average diameter of 29 ± 2 nm and a mean maximum absorption wavelength (Lambda max) of 391 ± 2 nm, while the TCh-AgNPs had an average diameter of 66 ± 1 nm and a mean Lambda max of 418 ± 2 nm. After the development and characterization of TCh-AgNPs, anti-rK39 antibodies were attached to the surface of the nanoparticles (TCh-AgNPs@Ab) in a reaction mediated by EDC/NHS. These formed particles were evaluated regarding their immunodiagnostic potential. A biosensor based on surface plasmon resonance (SPR) technique was constructed by covalently binding the rK39 protein onto a previously functionalized gold substrate, and the binding potential of rK39 with TCh-AgNPs@Ab and free antibodies was observed. From this study, it was observed that the kinetics of the reaction were favored, and higher detectability was achieved with TCh-AgNPs@Ab. Additionally, TCh-AgNPs and TCh-AgNPs@Ab were tested against Leishmania promastigotes, resulting in a mortality rate of 79.02 ± 3.5% and 87.66 ± 13.5%, respectively, indicating good leishmanicidal action. Safety tests were also conducted, such as cytotoxicity assessment in macrophages and the comet assay in lymphocytes. Based on the data obtained, the particles demonstrated a high diagnostic potential and good leishmanicidal activity