Acurácia do ensaio GenoType LepraeDR® no diagnóstico molecular da hanseníase e na identificação de mutações em genes associados à resistência medicamentosa

Abstract

Resumo: A hanseníase é uma doença infecciosa debilitante, causada pelo Mycobacterium leprae. O Brasil ocupa o segundo lugar mundial em número de novos casos. O diagnóstico de hanseníase em sua maior parte é feito com base nos sinais e sintomas clínicos. Entretanto, aproximadamente 30% dos pacientes não apresentam sintomas cardinais. Mesmo quando baciloscopia e histologia são solicitadas como exames confirmatórios, estes podem ser negativos para uma parte dos pacientes que apresentam poucas lesões. Sem diagnóstico preciso, aumenta a probabilidade de transmissão da doença e de aparecimento de incapacidades relacionadas à doença. Dentro deste contexto, os métodos moleculares para o diagnóstico da hanseníase são considerados estratégias promissoras na área. Entretanto, poucos foram implementados formalmente no sistema público de saúde de países endêmicos. Nosso objetivo foi avaliar a acurácia de um teste comercial baseado em hibridização reversa, o GenoType LepraeDR®, que se propõe a identificar por meio da detecção de material genético o M. leprae e suas mutações de resistência medicamentosa. Para tanto, os resultados foram comparados com as metodologias de qPCR de genes alvo RLEP, folP1, rpoB e gyrA e nested qPCR dos genes folP1, rpoB e gyrA para diagnóstico e com sequenciamento de Sanger para identificações de mutações de resistência medicamentosa. Em seguida, simulamos o uso de um protocolo em série composto por uma triagem inicial usando o GenoType LepraeDR®, seguido pelo nested qPCR do gene rpoB. Foram incluídos 80 indivíduos no presente estudo e 53 tiveram o diagnóstico de hanseníase, enquanto os 27 restantes foram classificados como controles. O teste GenoType LepraeDR® (sensibilidade: 0,45, especificidade: 1) teve desempenho semelhante à qPCR do gene rpoB (sensibilidade: 0,49, especificidade: 1). Além disso, o ensaio foi mais específico e menos sensível que o RLEP (sensibilidade: 0,89, especificidade: 0,85), folP1 (sensibilidade: 0,62, especificidade: 0,41), nested rpoB (sensibilidade: 0,64, especificidade: 0,93), gyrA (sensibilidade: 0,64, especificidade: 0,96) e nested gyrA (sensibilidade: 0,64, especificidade: 0,96). O protocolo em série GenoType LepraeDR® seguido do nested qPCR do gene rpoB resultou em melhor acurácia (0,76). Provavelmente devido ao número amostral pequeno, não foram encontradas as principais mutações que causam resistência, porém os dados obtidos a partir do sequenciamento de Sanger e o ensaio comercial foram concordantes. O teste GenoType LepraeDR® apresenta algumas vantagens, incluindo especificidade de 100% e capacidade de detecção simultânea de resistência antimicrobiana. Um protocolo em série usando o GenoType LepraeDR® seguido de nested qPCR para o gene rpoB mostrou-se uma estratégia prática e de possível execução.

Abstract: Leprosy is a debilitating infectious disease caused by Mycobacterium leprae. Brazil ranks second in the world in number of new cases. The diagnosis of leprosy is mostly based on clinical signs and symptoms. However, approximately 30% of patients do not have cardinal symptoms. Even when bacilloscopy and histology are requested as confirmatory tests, these may be negative for some patients who have few lesions. Without a precise diagnosis, the probability of disease transmission and the onset of disease-related disabilities increases. Within this context, molecular methods for diagnosing leprosy are considered promising strategies in the area. However, few of these have been formally implemented in the public health system of endemic countries. Our objective was to evaluate the accuracy of a commercially available test based on reverse hybridization, the GenoType LepraeDR®, which proposes to identify, through the detection of genetic material, M. leprae and its drug resistance mutations. Therefore, the results were compared with the methodologies of qPCR using target genes RLEP, folP1, rpoB and gyrA and nested qPCR for genes folP1, rpoB and gyrA for diagnosis and were compared with Sanger sequencing for identification of drug resistance mutations. Then, we simulated the use of a serial protocol composed of an initial screening using the GenoType LepraeDR® followed by the nested qPCR for rpoB gene. We included 80 individuals in the present study and 53 had a positive diagnosis for leprosy, while the remaining 27 were classified as controls. The GenoType LepraeDR® test (sensitivity: 0.45, specificity: 1) performed similarly to rpoB qPCR (sensitivity: 0.49, specificity: 1). The commercially available assay was more specific and less sensitive than RLEP (sensitivity: 0.89, specificity: 0,85), folP1 (sensitivity: 0.62, specificity: 0,41), nested rpoB (sensitivity: 0.64, specificity: 0,93), gyrA (sensitivity: 0.64, specificity: 0,96) and nested gyrA tests (sensitivity: 0.64, specificity: 0,96). The serial protocol of GenoType LepraeDR® followed by the nested qPCR rpoB resulted in better accuracy (0.76). Probably due to the small sample size, the main mutations that cause resistance were not found, but the data obtained from Sanger sequencing and the commercially available assay agreed. The GenoType LepraeDR® test has some advantages, including 100% specificity and ability to simultaneously detect antimicrobial resistance. A serial protocol using the GenoType LepraeDR® followed by nested qPCR for the rpoB gene proved to be a practical and possible implementation strategy.