Atividade antimicrobiana e compostos bioativos dos extratos liofilizados do cogumelo gigante Macrocybe titans (H.E Bigelow & Kimbr)

Abstract

Resumo: Os fungos são conhecidos como produtores de muitos compostos químicos bioativos, sintetizados em diferentes fases de seus ciclos de vida. Os basidiomicetos são consumidos rotineiramente como alimentos nutracêuticos em muitas culturas orientais. Os compostos bioativos são produzidos tanto nos basidiomas, quanto no micélio vegetativo destes organismos. O objetivo principal desse trabalho foi investigar a ação antibacteriana de diferentes extratos obtidos a partir dos basidiomas de Macrocybe titans, e a caracterização química dos compostos fenólicos. Quatro metodologias de extração foram realizadas a partir da biomassa seca do isolado de M. titans denominado MT31: Banho de ultrassom, Ponteira ultrassônica, Extração com agitação em Shaker e Extração estática a frio. Os extratos liofilizados foram submetidos à testes de atividade biológica contra as bactérias Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae. Os melhores resultados de inibição bacteriana obtidos pelo teste de disco-difusão foram observados contra S. aureus e K. pneumoniae, com tamanho médio de halo de inibição de 27,8 e 23,1 mm, respectivamente. As análises de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) demonstram uma marcante atividade antimicrobiana para todos os extratos testados. S. aureus foi a bactéria mais suscetível à ação do extrato com a CIM de 0,99 mg/mL. Através da (CBM) foi possível confirmar também a atividade bactericida mínima dos extratos em relação às cepas bacterianas testadas. Foram realizadas análises de determinação de fenólicos totais, flavonoides e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) de todos os extratos. Os extratos denominados AgBu (10,6 mg/g) e ActPu (2,9 mg/g) apresentaram elevada taxa de compostos fenólicos e flavonoides respectivamente. Os resultados das análises por CLAE demonstram que o isolado MT31 produz compostos que podem estar relacionados com a inibição do crescimento e desenvolvimento das bactérias. Foram identificados e quantificados oito compostos fenólicos, sendo o mais predominante em todos os extratos o ácido clorogênico variando de 0,9302 a 0,4775 mg/g, para ActBu e AgSK, respectivamente. Adicionalmente, realizou-se ensaios de padronização de condições de amplificação do material genético, e testes de anelamento de primers para a avaliação preliminar da ativação da expressão de genes relacionados com a produção de Peptídeos Antimicrobianos (PAMs) pela técnica de RT-qPCR, embora ainda preliminares, demonstraram um sinal tardio de amplificação para o gene DLP2 (defensin-like protein) em micélio desafiado com S. aureus, quando comparado com a amostra controle.

Abstract: Fungi are known to produce many bioactive chemical compounds, synthesized at different stages of their life cycles. Basidiomycetes are routinely consumed as nutraceutical foods in many eastern cultures. Bioactive compounds are produced both in the basidiomes and in the vegetative mycelium of these organisms. Bioactive compounds are produced both in the basidiomes and in the vegetative mycelium of these organisms. The main objective of this work was to investigate the antibacterial action of different extracts obtained from the Macrocybe titans basidiomes, and the chemical characterization of the phenolic compounds. Four extraction methodologies were performed from the dry biomass of the M. titans isolate called MT31: Ultrasonic bath, Ultrasonic tip, Extraction with shaking in Shaker, and Cold static extraction. The lyophilized extracts were submitted to tests of biological activity against the bacteria Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and Klebsiella pneumoniae. The best bacterial inhibition results obtained by the disk-diffusion test were observed against S. aureus and K. pneumoniae, with an average size of the inhibition halo of 27.8 and 23.1 mm, respectively. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) analyses demonstrate a marked antimicrobial activity for all tested extracts. S. aureus was the bacteria most susceptible to the action of the extract with a MIC of 0.99 mg/mL. Through (MBC) it was also possible to confirm the minimum bactericidal activity of the extracts to the bacterial strains tested. Analyzes were performed to determine the total phenolics, flavonoids, and High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) of all extracts. The extracts called AgBu (10.6 mg/g) and ActPu (2.9 mg/g) showed a high rate of phenolic compounds and flavonoids, respectively. The results of HPLC analyses demonstrate that the MT31 isolate produces compounds that may be related to the inhibition of bacterial growth and development. Eight phenolic compounds were identified and quantified, the most prominent in all extracts being chlorogenic acid ranging from 0.9302 to 0.4775 mg/g for ActBu and AgSK, respectively. Additionally, tests were carried out to standardize conditions for amplification of the genetic material, and primer annealing tests for the preliminary evaluation of the activation of the expression of genes related to the production of Antimicrobial Peptides (AMPs) by the RT-qPCR technique, although still preliminary, demonstrated a late amplification signal for the DLP2 gene (defensin-like protein) in mycelium challenged with S. aureus, when compared with the control sample.