Estudo citotóxico in vitro dos efeitos do chumbo inorgânico [Pb(II)] em macrófagos peritoneais de camundongo

Abstract

Resumo: No presente trabalho foram avaliados os efeitos do.chumbo inorgânico [Pb (II)] em macrófagos (MFis) peritoneais de camundongo Mus musculus, através de ensaios in vitro de cultivo primário. Estes MFs foram expostos a duas concentrações do xenobionte (20 e 40µM) por períodos de 4, 24 e 72h, após manutenção em cultura de 24 horas. Para avaliarmos os efeitos do Pb (II) nos MFis, foram utilizadas várias técnicas, como a exclusão do azul de Tripan para determinação da viabilidade celular, o ensaio de fagocitose, o teste cometa, o ensaio de adesão, etc. Outro aspecto avaliado foi a morfologia celular, tanto ao nível estrutural como ultraestrutural, através de microscopia óptica (MO), eletrônica de transmissão (MET) e eletrônica de varredura (MEV). Foram também utilizadas técnicas de fluorescência para visualização de microfilamentos de actina, FAK, integrina alfa5 e Bax. Utilizando critérios morfológicos pôde ser observado que os MFis tratados apresentaram alterações estruturais e de comportamento, quando comparados com os MFiS do grupo controle. Essas alterações - sob MFiS tratados incluem citoplasma claro e vacuolizado, presença de várias projeções citoplasmáticas e de grânulos citoplasmáticos densos, núcleo com muita eucromatina e nucléolos evidentes. Através de MET ficaram evidentes a presença de muitos vacúolos, alto grau de condensação da cromatina e a presença de muitos blebs. Com relação às análises de MEV, foi possível observar que o Pb (II) altera a distribuição e o número de filopódios e que estes apresentam aborescentes com inúmeras projeções ramificadas e colapsadas e lamelopódios, assim como a ocorrência de blebs. Os resultados mostraram que, nos grupos tratados, microfilamentos e a FAK se distribuem de forma irregular. MFis tratados apresentam-se mais espraiados e com clusters de integrina a5, sugerindo uma dinâmica de adesão e/ou migração celular. Utilizando ensaio de adesão celular foi verificado que o espraiamento celular e a distribuição da integrina não se devem a um estímulo adesivo, ao menos sobre cobertura de fibronectina, visto que os MFis do grupo controle apresentaram resultados similares aos dos grupos expostos ao xenobionte. A expressão para proteína Bax confirma os resultados de MET, onde figuras apoptóticas foram identificadas nos MFis expostos ao Pb (II). Finalmente, foi observado através do teste Cometa que o Pb (II) pode causar danos no DNA. Os resultados sugerem que o Pb (II), mesmo em baixas concentrações e curtos períodos de exposição, pode causar uma série de alterações morfológicas e estruturais. Ele pode estar interferindo em mecanismos funcionais dos MFiS, gerando alterações nas interações entre certos ligantes e receptores de membrana e pode também estar interferindo com os mecanismos energéticos dessas células, através de ligação covalente a biomoléculas. O Pb (II) também pode causar distúrbios na homeostase do cálcio, levando a morte celular programada ou apoptose. Então, as alterações observadas nos MFis expostos ao xenobionte supracitado, podem interferir não apenas na manutenção estrutural e funcional das células, como também comprometer o sistema imunológico dos mamíferos.

Abstract: We have evaluated in this work the inorganic lead [Pb (II)] effects on mice Mus musculus peritoneal macrophages (MFis), through in vitro primary culture approach. These MFis were exposed to two xenobiotic concentrations (20 e 40µM) during 4, 24 and 72h, following a 24h culture period. In order to evaluate the Pb (II) effects on these cells, many procedures were used, such as the Tripan blue exclusion viability technique, phagocytosis and adhesion essays, Comet test and so on. Another aspect assessed was related to MFis morphology, at the structure and ultrastructure leveis, through optic microscopy (OM) as well as transmission (TEM) and scanning electronic microscopy (SEM). Fluorescence and immunofluorescence techniques were also used with the intention of visualizing the actin microfilaments, FAK, integrin alfa5 and Bax. The results of these evaluations were based on morphological criteria, which enabled the observation that the exposed MFis presented structural alterations in shape and behaviour, if compared with the control group. A clear and vacuolated cytoplasm, many projections and dense cytoplasmatic granules, the presence of euchromatin rich big nucleus and evident nucleolus are examples of the MFiS alterations after the exposition to Pb (II) on OM. Regarding the alterations at the ultrastructural levei under TEM, the presence of many vacuoles, a high chromatin condensation and the occurrence of many blebs on cell's surface. Considering the SEM analyses, it's possible to observe that Pb (II) alters the distribution and the number of filopodium and lamellipodium as well as blebs. The cytoskeleton's marking showed an irregular distribution of the actin and FAK protein. Sharply spreading MFis presented clusters of integrin a5 receptors into common cell's projections, suggesting at a first look, adhesion dynamics and/or cellular migration. The MFis spreading did not represent an adhesive stimulus, at least on fibronectin coat, since the MFis from the control group presented similar results in comparison to the treated groups. The Bax protein gene expression confirms the TEM results, where apoptotic structures were identified on MFis exposed to Pb (II). Finally, it was observed through Comet test that this xenobiotic might cause DNA damage. Ali these results suggest that Pb (II), even at low concentrations and short-term exposition, causes a large number of morphologic alterations. Pb (II) might be interfering in MFis functional mechanisms, originating alterations in the interactions between certain molecules and their membrane receptors and interfering with the energy mechanisms of these cells through covalent linkage to biomolecules, and also it might be disturbing the calcium homeostasis, leading this way, to the programmed cellular death, also called apoptosis. Then, the alterations presented by MFis exposed to the aforesaid xenobiotic do may not interfere only with structural and functional maintenance, but may also compromise the whole immune system of these mammals.

Resumo: No presente trabalho foram avaliados os efeitos do chumbo inorgânico [Pb (II)] em macrófagos (macrófagos) peritoneais de camundongo Musmusculus, através de ensaios in vitro de cultivo primário. Estes macrófagos foram expostos a duas concentrações do xenobionte (20 e 40pM) por períodos de 4, 24 e 72h, após manutenção em cultura de 24 horas. Para avaliarmos os efeitos do Pb (II) nos M<t>s, foram utilizadas várias técnicas, como a exclusão do azul de Tripan para determinação da viabilidade celular, o ensaio de fagocitose, o teste cometa, o ensaio de adesão, etc. Outro aspecto avaliado foi a morfologia celular, tanto ao nível estrutural como ultraestrutural, através de microscopia óptica (MO), eletrônica de transmissão (MET) e eletrônica de varredura (MEV). Foram também utilizadas técnicas de fluorescência para visualização de microfilamentos de actina, FAK, integrina a5 e Bax. Utilizando critérios morfológicos pôde ser observado que os macrófagos tratados apresentaram alterações estruturais e de comportamento, quando comparados com os macrófagos do grupo controle. Essas alterações - sob macrófagos tratados incluem citoplasma claro e vacuolizado, presença de várias projeções citoplasmáticas e de grânulos citoplasmáticos densos, núcleo com muita eucromatina e nucléolos evidentes. Através de MET ficaram evidentes a presença de muitos vacúolos, alto grau de condensação da cromatina e a presença de muitos blebs. Com relação às análises de MEV, foi possível observar que o Pb (II) altera a distribuição e o número de filopódios e que estes apresentam aborescentes com inúmeras projeções ramificadas e colapsadas e lamelopódios, assim como a ocorrência de blebs. Os resultados mostraram que, nos grupos tratados, microfilamentos e a FAK se distribuem de forma irregular. Macrófagos tratados apresentam-se mais espraiados e com clusters de integrina a5, sugerindo uma dinâmica de adesão e/ou migração celular. Utilizando ensaio de adesão celular foi verificado que o espraiamento celular e a distribuição da integrina não se devem a um estímulo adesivo, ao menos sobre cobertura de fibronectina, visto que os macrófagos do grupo controle apresentaram resultados similares aos dos grupos expostos ao xenobionte. A expressão para proteína Bax confirma os resultados de MET, onde figuras apoptóticas foram identificadas nos macrófagos expostos ao Pb (II). Finalmente, foi observado através do teste Cometa que o Pb (II) pode causar danos no DNA. Os resultados sugerem que o Pb (II), mesmo em baixas concentrações e curtos períodos de exposição, pode causar uma série de alterações morfológicas e estruturais. Ele pode estar interferindo em mecanismos funcionais dos macrófagos, gerando alterações nas interações entre certos ligantes e receptores de membrana e pode também estar interferindo com os mecanismos energéticos dessas células, através de ligação covalente a biomoléculas. O Pb (II) também pode causar distúrbios na homeostase do cálcio, levando a morte celular programada ou apoptose. Então, as alterações observadas nos macrófagos expostos ao xenobionte supracitado, podem interferir não apenas na manutenção estrutural e funcional das células, como também comprometer o sistema imunológico dos mamíferos.

Abstract: We have evaluated in this work the inorganic lead [Pb (II)] effects on mice Mus musculus peritoneal macrophages (macrophages), through in vitro primary culture approach. These macrophages were exposed to two xenobiotic concentrations (20 e 40pM) during 4, 24 and 72h, following a 24h culture period. In order to evaluate the Pb (II) effects on these cells, many procedures were used, such as the Tripan blue exclusion viability technique, phagocytosis and adhesion essays, Comet test and so on. Another aspect assessed was related to macrophages morphology, at the structure and ultrastructure leveis, through optic microscopy (OM) as well as transmission (TEM) and scanning electronic microscopy (SEM). Fluorescence and immunofluorescence techniques were also used with the intention of visualizing the actin microfilaments, FAK, integrin a5 and Bax. The results of these evaluations were based on morphological criteria, which enabled the observation that the exposed macrophages presented structural alterations in shape and behaviour, if compared with the control group. A clear and vacuolated cytoplasm, many projections and dense cytoplasmatic granules, the presence of euchromatin rich big nucleus and evident nucleolus are examples of the macrophages alterations after the exposition to Pb (II) on OM. Regarding the alterations at the ultrastructural levei under TEM, the presence of many vacuoles, a high chromatin condensation and the occurrence of many blebs on cell's surface. Considering the SEM analyses, it's possible to observe that Pb (II) alters the distribution and the number of filopodium and lamellipodium as well as blebs. The cytoskeleton's marking showed an irregular distribution of the actin and FAK protein. Sharply spreading macrophages presented clusters of integrin a5 receptors into common cell's projections, suggesting at a first look, adhesion dynamics and/or cellular migration. The macrophages spreading did not represent an adhesive stimulus, at least on fibronectin coat, since the macrophages from the control group presented similar results in comparison to the treated groups. The Bax protein gene expression confirms the TEM results, where apoptotic structures were identified on macrophages exposed to Pb (II). Finally, it was observed through Comet test that this xenobiotic might cause DNA damage. Ali these results suggest that Pb (II), even at low concentrations and short-term exposition, causes a large number of morphologic alterations. Pb (II) might be interfering in macrophages functional mechanisms, originating alterations in the interactions between certain molecules and their membrane receptors and interfering with the energy mechanisms of these cells through covalent linkage to biomolecules, and also it might be disturbing the calcium homeostasis, leading this way, to the programmed cellular death, also called apoptosis. Then, the alterations presented by macrophages exposed to the aforesaid xenobiotic do may not interfere only with structural and functional maintenance, but may also compromise the whole immune system of these mammals.