Avaliação do potencial antigenotóxico de polissacarídeos sulfatados em células de hepatocarcinoma humano

Abstract

Resumo: O fígado é responsável pela função fisiológica de destoxificação, reduzindo a toxicidade de compostos, porém sendo alvo constante da ação nociva de xenobióticos, requerendo a investigação de compostos com potencial hepatoprotetor. Polissacarídeos sulfatados (PSs) contém diversas propriedades farmacológicas reconhecidas (e.g. atividade anticoagulante, antitumoral, antioxidante). Desta forma, buscando maior similaridade com a condição in vivo, este trabalho desenvolveu um modelo in vitro 3D de hepatosferas de HepG2 para a avaliação do potencial hepatoprotetor (antigenotóxico) da Fucana A e da galactana das algas marinhas Spatoglossum Schroederi e Codium isthomocladum, respectivamente, contra MMS 0,5 mM e H2O2 100 µM, através do ensaio Cometa alcalino usual e modificado (detecção de danos oxidativos pelo emprego de hOOG1). O modelo criado demonstrou que: o período de 3 ou 5 dias em hanging drop influencia a morfologia e o diâmetro dos esferoides (melhores em 3 dias); a transferência das hepatoesferas fez necessário recobrimentos com agarose a 1,5% para não adesão celular em placas de 96-poços (mais eficiente que PolyHEMA a 2,5% e BSA a 2%); a quantidade de células iniciais pouco altera o diâmetro das hepatoesferas, porém a redução de SFB no meio de cultivo nas placas de 96-poços (de 10% para 1%) resultou em esferoides de tamanho controlado e morfologicamente mais estáveis. O modelo foi reprodutível com 125 células iniciais e apresentou diâmetro de ~200-250 µm com características saudáveis visualizadas pela marcação de PI e faloidina. Porém, a membrana celular mais resistente à lise prejudicou a realização do ensaio Cometa com células das hepatoesferas. Desta forma, a atividade genotóxica ausente e a forte atividade antigenotóxica contra danos oxidativos da fucana A e CI (Fucana A: 75,61% e CI:72,76%), em pré-tratamento de 72h, e moderada (Fucana A: 42,25%; CI: 49,55%), em tratamento simultâneo, foi observada em modelo 2D. Conclui-se que são necessárias mais adaptações no emprego de culturas organotípicas de HepG2 a testes de genotoxicidade e que a Fucana A e a galactana CI são promissores suplementos alimentares com ação hepatoprotetora através do efeito antigenotóxico.

Abstract: The liver is responsible for the physiological function of detoxification, reducing the toxicity of compounds, although, is a constant target of the harmful action of xenobiotics, requiring a research of compounds with hepatoprotective potential. Sulphated polysaccharides (SPs) contain several recognized pharmacological properties (eg. anticoagulant, antitumor, antioxidant activities). In this way, searching for greater similarity with an in vivo condition, this work developed an in vitro 3D model of HepG2 hepatospheres cells to evaluate the hepatoprotective (antigenotoxic) potential of fucan A and galactan of the Spatoglossum Schroederi and Codium isthomocladum seaweeds, respectively, against 0.5 mM MMS and 100 µM H2O2, thru alkaline and alkaline modified versions (detection of oxidative damage using hOOG1) of Comet assay. The hepatosphere model created showed that: the period of 3 or 5 days in hanging drop condition influences the morphology and diameter of spheroids (enhanced in 3 days); Transfer of the formed hepatospheres to 96-well plates required pre coatings of agarose 1.5% to inhibit cell adhesion (more efficient than PolyHEMA 2.5% and BSA 2%); number of initial cells almost don't influence hepatospheres size, but the reduction of fetal bovine serum (from 10% to 1% in the 96-well plates) resulted in spheroids with stable sizes and morphology. The model was reproducible with 125 initial cells and presented a diameter of 200-250 µm with healthy organotypic characteristics visualized by PI and phalloidin staining. However, more resistant cell membrane to lysis impaired the performance of the Comet assay with hepatosphere cells. Thus, absent genotoxic activity and strong antigenotoxic activity against oxidative damages of Fucan A and CI (Fucana A: 75.61% and CI: 72.76%), in pre-treatments of 72h, and moderate (Fucana A: 42.25%, CI: 49.55%), in simultaneous treatments with the genotoxicants, was observed in 2D model. In conclusion, further studies are required to HepG2 organotypic cultures application in genotoxicity assays, and the PSs, fucan A and galactan CI are promising dietary supplements with hepatoprotective action through antigenotoxic effect.