Produção de lipases por fermentação no estado sólido e sua utilização em biocatálise

Abstract

Resumo: O objetivo deste trabalho foi estudar a produção da lipase de Burkhoideria cepacia LTEB1 por fermentação no estado sólido, aliando o aproveitamento de resíduos agroindustriais à produção de uma enzima com características especiais para utilização em biocatálise. Foram estudados os substratos: farelo de casca de trigo com 0 a 5 % (v/m) de óleo de oliva; torta de milho (Corn Products Brasil, Mogiguaçu, SP) com 0 a 5 % (v/m) de óleo de milho, e farelo de sementes de girassol sem adição de óleo. A atividade enzimática foi determinada pelo método da hidrólise do palmitato de p-nitrofenila e confirmada pelo método titulométrico usando tributirina, tricaprilina e trioleína. Dentre todos os resíduos estudados, o farelo de semente de girassol proporcionou o melhor resultado: 240 U/gss (unidades por grama de substrato seco), nas condições de 55 % (m/m, base úmida) de umidade e 29°C, após 72 h de fermentação. O sólido fermentado liofilizado produzido a partir do resíduo industrial torta de milho (108 U/gss) foi empregado nos estudos da síntese do oleato de etila em n-heptano usando-se um delineamento fatorial 2³, estudando-se as variáveis temperatura, quantidade de enzima no meio reacional (U) e razão molar (RM, ácido:álcool). O rendimento em éster foi avaliado pelo método de Lowry- Tinsley. As melhores condições para a produção do éster foram 37°C, RM de 1:5 e a máxima quantidade de enzima no meio (60 U), obtendo-se um rendimento de 93,6% após 18 h. Apesar do rendimento de síntese do oleato de etila, catalisado pelo sólido fermentado farelo de sementes de girassol ter sido menor (76,4% ± 1,1) do que a torta de milho, o tempo necessário para atingir o equilíbrio foi reduzido para 8 h. O farelo de sementes de girassol foi reutilizado 10 vezes para a reação de síntese do oleato de etila sem queda no rendimento e 14 vezes até atingir a metade do rendimento obtido inicialmente. Elevando-se a quantidade de sólido fermentado no meio reacional foi possível reduzir o tempo de reação para apenas 3 h. A comparação do rendimento da reação de síntese com o extrato bruto, preparado por extração do sólido fermentado farelo de sementes de girassol com NaCl 3% (m/v), precipitado com sulfato de amônio, dialisado e liofilizado, mostrou que o rendimento e o tempo de reação para a máxima produção de éster para o extrato bruto (65,5%, após 24 h) foram menores do que os obtidos para os sólidos fermentados torta de milho e farelo de sementes de girassol. O éster oleato de etila produzido foi purificado e em seguida quantificado através de três técnicas: espectrofotométrica (Método de Lowry-Tinsley), CLAE e RMN ¹H. Os resultados obtidos neste trabalho são inéditos e mostram a viabilidade de utilização de sólidos fermentados diretamente em reações de síntese de ésteres em solventes orgânicos.

Abstract: The objective of this study was to produce the lipase of Burkhoideria cepacia LTEB1 by solid-state fermentation, in this manner taking advantage of agricultural residues for the production of an enzyme that is useful in biocatalysis. Several substrates were studied: wheat bran (WB), supplemented with 0 to 5% (v/m) olive oil, corn bran (CB) (Corn Products Brasil, Mogiguaçu, SP), supplemented with 0 to 5% (v/m) corn oil, and sunflower seed meal (SSM), without the addition of oil. Enzyme activity of the crude extract in aqueous medium was determined by the hydrolysis of p-nitrophenol phosphate (pNPP) and confirmed by the titrimetric method using tributyrin, tricaprylin and triolein. Of the three substrates, SSM gave the highest yield of activity, 240 units per gram of dry matter (gDM), obtained with an initial water content of 55% (w/w, wet basis), after 72 h at 29°C. Lyophilized fermented substrate produced from corn bran (CB), with a pNPP hydrolyzing activity of 108 U/gDM, was used in studies of the synthesis of ethyl oleate in n-heptane. A 2³ factorial experiment was undertaken, with the variables being the temperature (T) quantity of enzyme added to the reaction medium (U) and the molar ratio of acid to alcohol (MR). The ester yield was determined through the disappearance of oleic acid, using the method of Lowry-Tinsley. The best conditions for ester synthesis were 37°C, a molar ratio of 1:5 and the highest quantity of enzyme tested (60 U). Under these conditions the ester yield was 93.6% after 18 h. The synthesis of the ester was further studied using SSM under the same conditions as used for CB. The ester yield was lower than that obtained with CB under the same conditions (76.4%), but the time taken to reach equilibrium was reduced to 8 h. With an increase in the amount of SSM fermented solid added to the reaction medium it was possible to reduce the reaction time to as little as 3 h. The same batch of SSM was reutilized 10 times for the synthesis of ethyl oleate without any loss of yield. After the 14th reuse the yield was 50%. For the purpose of comparison, a crude lipolytic extract was prepared by extracting SSM with 3% (w/v) NaCl. This extract was precipitated with ammonium sulphate, the precipitate then being re-suspended, dialyzed and lyophilized. The maximum ester yield (65.5%) and time taken to obtain this maximum (24 h) were worse for this crude extract than for direct addition of either SSM or CB fermented solids. The ethyl oleate produced during the reactions was purified and quantified by three separate techniques, a spectrophotometric technique (the method of Lowry-Tinsley), HPLC and 1H-NMR. This thesis represents the first report of the biocatalytic synthesis of esters in organic media through the direct addition of a fermented solid produced by solid-state fermentation.