Desenvolvimento de bioprocesso para a produção de esporos termorresistentes de Bacillus atrophaeus

Abstract

Resumo: A esterilização é de fundamental importância no controle das infecções dos serviços de saúde. Falhas nesse processo podem levar à transmissão de doenças infecciosas. Para assegurar a eficiência da esterilização, as principais instituições normativas mundiais de saúde recomendam o uso rotineiro de Indicadores Biológicos (IB) para seu monitoramento, no Brasil esta é uma exigência legal. Os consultórios odontológicos, na sua grande maioria, utilizam o calor seco como principal método de esterilização. Pesquisas demonstram que a maioria destes serviços não atende a esta exigência devido ao alto custo e à dificuldade de aquisição destes IB. Esporos do Bacillus atrophaeus são recomendados como IB para esterilização por calor seco devido à sua alta resistência térmica. Na primeira etapa deste trabalho, utilizando meios de cultura sintéticos, foram investigados aspectos de rendimento de produção e de resistência térmica dos esporos, em função da composição dos meios de cultura do inóculo, meios de esporulação e recuperação, bem como do material do suporte. O tempo de incubação do inóculo foi padronizado em 18 horas; o meio constituído de extrato de levedura, 0,8%; caldo nutriente, 0,4%; MnSO4.4H2O, 0,005%; CaCl2.6H2O, 0,005% e ágar, 3,0%, foi o que apresentou a melhor relação produtividade x facilidade no preparo. O IB embalado em frasco com papelote como suporte apresentou maior resistência térmica e permitiu melhor visualização do produto. Objetivando uma maior estabilidade do produto, a solução de acetato de cálcio 0,02M foi escolhida como diluente. A concentração 0,0015% de azul de bromotimol, com a adição de 0,1% de amido no meio de recuperação, forneceram um D160°C, em média, 7,0% maior e um Usk,160°C, em média, 5,4% maior. Um lote experimental da suspensão de esporos e um lote experimental do IB foram produzidos, e os resultados (Usk,160°-C = 37,4 ± 1,5 min e D16o°c = 5,5 ± 0,3 min) atenderam aos critérios de qualidade preconizados pelas normas internacionais. Na segunda parte, foi desenvolvida metodologia de produção de esporos termorresistentes utilizando resíduos e subprodutos agroindustriais da soja e da cana-de-açúcar como substrato. Realizou-se a seleção das matériasprimas, da técnica de cultivo, do reator e a otimização das variáveis físicas, químicas e nutricionais do cultivo. No preparo do inóculo, o melaço de soja a 4,0%, adicionado de peptona a 4,0%, proporcionou biomassa entre 8,4 x 107 a 2,1 x 1010 UFC.mL-1. A fermentação em estado sólido (FES) foi otimizada: bagaço de cana como suporte (1,0 mm como tamanho médio da partícula); melaço de soja a 2 ,0% e sais estimuladores da esporulação como substrato; 3% como taxa do inóculo (107 UFC.g1 de matéria seca); umidade inicial de 93%; pH 8,0; água como diluente, tempo de incubação de 7 dias e saco plástico como reator, fornecendo 1010 UFC.g-1 de massa seca. Resultando em um acréscimo de até 3 log e propiciando uma redução de 50% do tempo de incubação em relação à produção em ágar. A análise da resistência térmica dos esporos produzidos forneceu um D16o°c = 5,2 ± 0,2 min, superior ao preconizado pela USP (D160°C = 3,0 min).

Abstract: Effective sterilization is important in avoiding cross-infections and the transmission of infectious diseases. The Health Services’ current guidelines on infection control practices recommend regular biological monitoring of sterilizers for it is a legal requirement. Most dental and medical facilities still use dry heat sterilizers as a current practice. Researches have shown that only few dental offices apply biological monitoring of sterilization for its high cost is a hindrance to its widespread use. For dry heat sterilization, more specifically, Bacillus atrophaeus spores are recommended due to its high thermal resistance to this process. Aiming at developing a costeffective product, in the first stage of this research, aspects of their roduction effectiveness and spore thermal resistance, different compositions of sporulation and recovery synthetics culture media, and the support spore material were evaluated. The inoculum incubation time was standardized as 18 hours, and the best cost/productivity relation sporulation medium was: yeast extract, 0.8%; nutrient broth, 0.4%; MnSO4.4H2O, 0.005%; CaCl2.6H2O, 0.005% and agar, 3.0%. The inoculated strips put into sterile glass vial showed higher thermal resistance and allowed better product visualization. Calcium acetate solution 0.02 M was chosen as a diluent’s in order to maintain the product’s stability. Recovery medium with bromotimol blue, 0.0015 % and starch, 0.1%, provided a 7.0% higher D160°C and a 5.4% higher Usk,i60°c, on average. An experimental spore suspension batch was produced and the obtained results (Usk,i60°C = 37.4 ± 1.5 min and D160°C = 5.5 ± 0.3 min) met the international quality standard criteria. In the second part, a methodology for thermal resistant spore production using soybean and sugar cane by-products was developed. Different substrates, fermentation techniques, and reactors were evaluated and chemical, physical, and nutrition characteristics of the culture were optimized. An optimized inoculum medium containing 4.0% soybean molasses and 4.0% casein peptone was similar in performance to a synthetic control medium resulting in 8.4 x 107 to 2.1 x 1010 CFU.mL-1 of biomass. The SSF using sugar cane bagasse as support and soybean molasses 2 .0%, supplemented with sporulation inductor salts, was the best technique and its variable optimum values were: particle size, 1.0 mm - mean; inoculum’s size, 3% (107 CFU.g-1 dry matter), moisture content, 93%; initial substrate pH, 8.0; water as a solution base, plastic bag as a reactor, and seven days as incubation time. The high-yield spore production was about 3 log higher as compared to the control agar medium, and 1 log increase over the first SSF study. The dry-heat resistance analysis gave a D160°C-value result (5.2 ± 0.2 min), higher than the one recommended by the USP (D160°C = 3.0 min).