Temperatura na indução da embriogênese somática em Pinus taeda e Pinus elliotti x P. caribaea var. hondurensis e azacitidina para reaquisição de competência embriogênica

Abstract

Resumo: A embriogênese somática é uma técnica de clonagem de alta eficiência, na qual, a partir de qualquer tecido vegetal e sob condições adequadas, ocorre um processo de desdiferenciação e rediferenciação celular com a consequente formação de embriões somáticos. Dentre os gargalos da técnica, observa-se que ao permanecerem em proliferação por mais de dez repicagens as massas pró-embriogênicas (MPEs) apresentam perda de competência embriogênica (CE), que pode estar relacionada a processos epigenéticos. Além disso, devido a baixa taxa de indução de massas próembriogênicas (MPEs) a partir de megagametófitos imaturos observada para as coníferas, os protocolos ainda necessitam de ajustes, podendo a temperatura ser um fator determinante. Como objetivos deste trabalho são elencados: avaliar o efeito (i) da temperatura e do genótipo na embriogênese somática em Pinus taeda (Pt) e Pinus elliottii x P. caribaea var. hondurensis (PExPCH); e (ii) do agente hipometilante azacitidina (5-azaC) na reaquisição da CE nas linhagens ECL02 e ECL05 do híbrido PExPCH. Para o experimento (i), megagametófitos de 5 genótipos de Pt foram submetidos às temperaturas 15°C, 23°C e 28°C e ainda a choque térmico de 60°C por 5 min seguido de incubação a 23°C. Após 10 semanas no escuro, foram avaliados quanto a taxa de indução de MPEs e oxidação, além da proliferação por sete semanas. Em (ii), MPEs permaneceram em subcultivo por 17 meses, 500 mg dessas foram expostas ao 5-azaC nas concentrações de 50 e 150 Mi M por 10 dias em meio de cultura ou cultivadas em meio controle desprovido de 5-azaC em quadruplicata para cada concentração. As coletas foram realizadas durante o experimento no terceiro e décimo dia, na sequência se procederam as análises de citoquímica com carmim acético e azul de Evans, assim como, para ECL05, metabolômica via CG-EM. Em ambos os experimentos, as MPEs seguiram para análise de expressão dos genes relacionados à totipotência Somatic Embryogenesis Receptor Kinase 1 (SERK1) e Leafy Cotyledon 1 (LEC1) via RT-qPCR. Os dados foram analisados pelo teste de Kruskall-Wallis (p < 0,05). Como resultado de (i), observou-se que a indução de MPEs não foi afetada pelas temperaturas aplicadas. O efeito do genótipo foi significativo (p < 0,01) na indução e os níveis de expressão de SERK1 e LEC1 aumentaram expressivamente nos tratamentos a 28°C e 60°C. No segundo experimento (ii), a reaquisição da CE em ECL05 foi identificada após exposição ao agente 5-azaC na concentração 150 ?M em todas as análises. Neste caso, foi observado o aumento de células embriogênicas, de metabólitos relacionados a CE e da expressão dos genes de interesse. Quanto a ECL02, na análise citoquímica não foi observado o aumento de células embriogênicas com a exposição ao 5-azaC e a análise de expressão gênica confirmou esse resultado. Desse modo, foi possível a seleção de genótipos com maior potencial embriogênico. Os resultados obtidos para a linhagem ECL05 sugerem que o agente 5-azaC pode ser efetivo na reaquisição da CE.

Abstract: Somatic embryogenesis is a highly efficient cloning technique, in which, from any plant tissue and under suitable conditions, a process of cell dedifferentiation and redifferentiation occurs, with the formation of somatic embryos. Among the bottlenecks of the technique, loss of embryogenic competence (EC) is observed when proembryogenic masses (MPEs) remain in proliferation medium for more than ten subcultures, which may be related to epigenetic processes. Furthermore, due to the low induction rate observed for conifers, the protocols still need to be adjusted, and temperature may have a decisive influence. The objectives of this work were: to evaluate the effect (i) of temperature and genotype on somatic embryogenesis in Pinus taeda (Pt) and Pinus elliottii x P. caribaea var. hondurensis (PExPCH); and (ii) of the hypomethylating agent 5-azacytidine (5-azaC) in the CE reacquisition for the ECL02 and ECL05 lines of the PExPCH hybrid. For experiment (i), megagametophytes from 5 Pt genotypes were subjected to temperatures of 15°C, 23°C and 28°C and heat shock at 60°C for 5 min followed by incubation at 23°C. After 10 weeks in the dark, the initiation rate of MPEs and oxidation were evaluated, in addition to proliferation for seven weeks. In (ii), MPEs remained in subculture for 17 months, and then 500 mg of these were exposed for 10 days to 5-azaC added to the culture medium at 50 and 150 Mi M as well as a control without 5-azaC, in quadruplicate for each concentration. After the third and tenth day samples were collected and submitted to cytochemical analyzes with acetic carmine and Evan's blue, as well as, for ECL05, metabolomic analyses via CG-EM. In both experiments (i and ii), the expression analysis of genes related to Somatic Embryogenesis Receptor Kinase 1 (SERK1) and Leafy Cotyledon 1 (LEC1) were carried out via RT-qPCR. Data were analyzed using the Kruskal-Wallis test (p < 0.05). As a result of (i), it was observed that the induction of somatic embryogenesis was not affected by the temperature. The effect of genotype was significant (P < 0.01) on induction rate and the expression levels of SERK1 and LEC1 increased significantly in treatments at 28°C and 60°C. In the second experiment (ii), the reacquisition of EC in ECL05 was observed after exposure to the agent 5-azaC at a concentration of 150 ?M in all analyses, where an increase in embryogenic cells, EC-related metabolites and expression of the genes of interest were observed. For ECL02, the cytochemical analysis did not show an increase in embryogenic cells with exposure to 5-azaC and the gene expression analysis confirmed this result. Thus, it was possible to select families with higher embryogenic potential. The results observed for ECL05 suggest that 5-azaC can be effective in the reacquisition of EC for PExPCH.