Diagnóstico sorológico, isolamento, cultivo e caracterizaçao molecular de Neospora caninum em bovinos leiteiros e em eqüinos no estado do Paraná, Brasil

Abstract

Resumo: O presente estudo teve por objetivo verificar a presença do protozoário Neospora caninum em bovinos e eqüinos procedentes de regiões distintas do Paraná. As amostras de soro dos animais foram avaliadas pelos métodos de imunofluorescência indireta e por ensaio imunoenzimático, para detectar os anticorpos contra N. caninum. As técnicas de isolamento em cultivo celular e em animais de laboratório foram empregadas para obter as cepas de N. caninum, a partir de amostras de cérebro de fetos e de bezerros. A detecção de anticorpos contra N. caninum em bovinos de todas as categorias, e em éguas, demonstraram uma exposição anterior ao parasita, nas regiões de Carambeí, Witmarsum, Quatro Barras, São José dos Pinhais e Campo Largo. O isolamento de cinco cepas de N. caninum em células Vero, e a caracterização molecular pela reação da polimerase em cadeia (PCR), confirmaram a neosporose clínica em fetos bovinos e eqüinos, e em bezerro com sinais neurológicos. As cepas de N. ccminum apresentaram diferenças de comportamento nos cultivos celulares, em relação aos períodos de isolamento, de estabelecimento, ao crescimento, a produção de antígenos com e sem a suplementação de soro no meio, e a recuperação. As inoculações dos taquizoítas de N. ccminum em camundongos Swiss Webster e em gerbils imunocompetentes, demonstraram uma resistência destes animais ao parasita, e uma pequena produção de cistos nos cérebros. As inoculações orais de tecidos de bezerros em cães, induziram a eliminação de oocistos não esporulados de N. ccminum nas fezes. As análises por PCR da seqüência Nc5 do DNA das cepas de N. caninum demonstraram diferenças genéticas entre as cepas isoladas de bovinos, de acordo com a região e a raça, e uma variabilidade genética entre as cepas de N. caninum de eqüinos, isoladas na mesma região. As cepas de N. caninum induziram anormalidades no sistema nervoso central e abortos em bovinos e em eqüinos. Os bovinos leiteiros e os eqüinos procedentes de propriedades com histórico de abortos apresentaram uma alta prevalência de anticorpos contra N. caninum. O diagnóstico de neosporose deveria ser incluído nos casos de abortos e doenças neurológicas em bovinos e eqüinos, devido ao isolamento de N. caninum dos fetos e bezerros.

Abstract: This study was designed to detect the Neospora caninum infections in bovine and equine from different regions of Parana State. The sera were screened for antibodies against N. caninum using an indirect fluorescent antibody test and an enzyme-linked immunosorbent assay. Cell culture and mouse inoculations were used to recover Neospora from bovine and equine fetuses and from calves. Antibodies to N. caninum were found in calves, heifers, adult cows and mares. These results provided indication that N. caninum is established in cattle and horses in Carambei, Witmarsum, Quatro Barras, São José dos Pinhais and Campo Largo. Five strains of Neospra were isolated in Vero cells and the identities of the parasites were confirmed by polymerase chain reaction (PCR). These isolates have confirmed the Neospora infection in bovine and equine fetuses and in a calf with nervous system abnormalities. The strains of Neospora had different in vitro growth characteristics. The tachyzoite yields were determined in non-serum supplemented medium and with horse serum. Isolates of N. caninum did not produce infection in Swiss Webster mice and gerbils. The number of tissue cysts produced was low. Unsporulated oocysts were shed in the feces of a dog following consumption of infected calf. PCR analysis of the protozoan strains DNA provided evidence for genetic differences among the isolates of N. caninum. Neospora infection caused bovine and equine abortion and nervous system abnormalities in a calf. A high seroprevalence of antibodies to N. caninum was found in cattle from herd with endemic pattern of abortion and in mares from a case of epidemic abortion. These finding and the isolation of the parasite from bovine and equine suggest that the diagnosis of Neospora infection should be included in cases of abortion and neurological diseases in these species.