Perfil de expressão de RNAs e polimorfismo de IncRNAs no pênfigo foliáceo endêmico

Abstract

Resumo: Nas últimas décadas, o uso de técnicas de sequenciamento em larga escala adicionou informações valiosas sobre a complexidade do genoma humano e de sequências não codificantes nele presentes. Por muito tempo uma porção considerável do genoma foi considerada DNA lixo por não codificar proteína, porém, estudos demonstraram que parte significativa do DNA é transcrita, mas não traduzida, e que muitos desses transcritos são importantes em processos essenciais às células. Entre eles estão os RNAs longos não codificadores (lncRNAs) que têm se destacado funcionalmente na regulação da expressão gênica. Compreender melhor a multiplicidade funcional do genoma contribui para o avanço no entendimento de doenças complexas nas quais fatores genéticos têm efeito. O pênfigo foliáceo (PF) é uma doença autoimune da pele na qual há a formação de autoanticorpos contra a desmogleína 1, uma proteína constituinte dos desmossomos responsáveis pela adesão entre queratinócitos. O PF se caracteriza pelo desprendimento da camada superior do epitélio, com formação de bolhas e erosões na pele. É uma doença em cuja patogênese atuam fatores ambientais e genéticos, e é endêmica em certas regiões geográficas do mundo, sendo o Brasil o país em que atinge sua maior incidência. Neste trabalho utilizamos duas abordagens principais com o objetivo de contribuir para uma melhor compreensão da patogênese do pênfigo foliáceo endêmico (PFE): uma, de análise de associação genética com polimorfismos de RNAs longos não codificadores (lncRNAs) e outra, de expressão diferencial em nível de RNA. Primeiramente investigamos a existência de associação entre 2.080 polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) localizados em genes de lncRNAs e o PFE, a fim de descrevermos variantes de predisposição à doença. Encontramos um SNP associado, rs7144332 localizado no lncRNA AL110292.1, e outros cinco SNPs sugestivos de associação, os quais podem alterar a função de lncRNAs e influenciar a susceptibilidade ao PFE. Na segunda abordagem, realizamos o sequenciamento de RNA (RNA-seq) de células T CD4+ de pacientes de PFE e de indivíduos sem a doença com o objetivo de descrever o perfil de mRNAs e lncRNAs com expressão alterada na condição de doença. Identificamos 324 genes diferencialmente expressos, entre esses, 32 genes de lncRNAs. Vários desses genes têm funções na resposta imune e inflamatória, e alguns deles já haviam sido encontrados diferencialmente expressos em PF em uma análise de microarranjo feita anteriormente. Por meio da técnica de PCR quantitiva (qPCR) validamos a diferença de expressão encontrada para os genes LEF1-AS1, IL18RAP, GNLY e S1PR5 em células T CD4+. Também avaliamos a expressão dos mesmos genes em células B de pacientes e controles, sendo que IL18RAP, GNLY e S1PR5 foram detectados diferencialmente expressos. Desta maneira, foi possível corroborar a participação de diversos genes codificadores e não codificadores de proteína no desencadeamento e/ou manutenção do PFE, além de apontar outros genes nunca antes implicados no pênfigo. Tais genes se destacam como candidatos interessantes para estudos posteriores, e podem tornar-se potenciais alvos terapêuticos em PF.

Abstract: In recent decades, the use of large-scale sequencing techniques has added valuable insights into the complexity of the human genome and the non-coding sequences present in it. For a long time, a considerable portion of the genome was considered junk DNA because it did not encode protein. However, studies have shown that a significant part of DNA is transcribed but not translated, and many of these transcripts are important in processes essential to cells. Among them are the long non-coding RNAs (lncRNAs) that have been functionally prominent in the regulation of gene expression. Better understanding of the functional multiplicity of the genome contributes to advancing the understanding of complex diseases in which genetic factors have an effect. Pemphigus foliaceus (PF) is an autoimmune disease of the skin in which there is the formation of autoantibodies against desmoglein 1, a protein constituent of the desmosomes responsible for adhesion between keratinocytes. PF is characterized by the detachment of the upper epithelial layer, with formation of blisters and erosions on the skin. It is a disease whose pathogenesis affects environmental and genetic factors and is endemic in certain geographic regions of the world. Brazil is the country where it reaches its highest incidence. In this work we used two main approaches with the aim of contributing to a better understanding of the pathogenesis of endemic pemphigus foliaceus (EPF): genetic association analysis with polymorphisms of long non-coding RNAs (lncRNAs) and differential expression analysis at the RNA level. We first investigated the association between 2,080 single nucleotide polymorphisms (SNPs) located in lncRNAs genes and EPF, in order to describe variants of predisposition to the disease. We found one associated SNP, rs7144332 located in the lncRNA AL110292.1, and other five SNPs suggestive of association, which may alter the function of lncRNAs and influence the susceptibility to EPF. In the second approach, we performed RNA sequencing (RNAseq) of CD4+ T cells from EPF patients and individuals without the disease aiming to describe the profile of mRNAs and lncRNAs whose expression is altered in the disease condition. We identified 324 differentially expressed genes, among them, 32 lncRNA genes. Several of these genes have functions in the immune and inflammatory response and some of them had previously been found differentially expressed in EPF by microarray analysis. Using the quantitative PCR technique (qPCR) we validate the expression difference found for the LEF1-AS1, IL18RAP, GNLY and S1PR5 genes in CD4+ T cells. We also evaluated the expression of the same genes in patients and controls B cells, and IL18RAP, GNLY and S1PR5 were detected differentially expressed. In this way, it was possible to corroborate the participation of several protein-coding and non-coding genes of in the onset and/or maintenance of EPF, and to point out genes never previously implicated in pemphigus. Such genes stand out as interesting candidates for further studies, and may become potential therapeutic targets in PF.