Efeito do extrato aquoso do macrofungo Macrocybe titans sobre a formação de biofilme de Candida albicans e Candida tropicalis : morfologia do biofilme e expressão de genes de virulência

Abstract

Resumo: Extratos de macrofungos têm sido estudados devido à grande variedade de seus bioprodutos. Para o cogumelo basidiomiceto Macrocybe titans existem poucos registros na literatura sobre o seu potencial antimicrobiano. Biofilmes são importantes fatores de virulência e resistência de micro-organismos, e a busca por novos agentes terapêuticos eficazes tem se tornado uma alternativa favorável ao combate às doenças infecciosas. As leveduras do gênero Candida são as principais causadoras de infecções oportunistas e nosocomiais, dentre suas espécies as mais incidentes são C. albicans e C. tropicalis. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivos elucidar o efeito do extrato aquoso de M. titans sobre a formação de biofilmes produzido por essas leveduras. O extrato aquoso foi preparado através da maceração do pó de basidiomas de M. titans em água purificada (1 g.mL-1). A atividade antibiofilme foi avaliada pelo método do cristal violeta, microscopia eletrônica de varredura e a microscopia de fluorescência (coloração por Calcofluor White), para biofilmes em formação e biofilmes pré-formados. A expressão de genes de virulência das leveduras nos biofilmes foi avaliada por qRT-PCR. Os primers utilizados foram, para C. albicans: UME6, CHT2 e ACT1b; e para C. tropicalis foram utilizados ALS1 e ACT1. Observouse que foi necessária a concentração de 32 mg.mL-1 para a inibição da formação de biofilmes em C. albicans, e de 16 mg.mL-1 para inibição de C. tropicalis. Os biofilmes formados de C. albicans e C. tropicalis foram desestruturados a partir das concentrações de 63 mg.mL-1 e 8 mg.mL-1, respectivamente. A análise das imagens corroborou os resultados do ensaio de cristal violeta, com a escassez de células nos biofilmes tratados em formação, e o aparecimento de espaços vazios entre os biofilmes pré-formados tratados, além de demonstrar a desconfiguração da parede celular das leveduras, com a formação de cicatrizes e rugosidades não características. Pôde-se observar a inibição da expressão dos genes UME6 e CHT2 nas células planctônicas tratadas tanto em formação, quanto pré-incubadas, bem como nas células sésseis de biofilme pré-formado, contudo, observou-se um pequeno aumento (~20%) na expressão gênica em biofilme em formação tratadas. Os resultados para o gene ALS1 se mostraram diminuídos para células planctônicas (~4 vezes menos expresso) e aumentados para células sésseis (de 1,5 a 2,5 vezes mais expresso). Os resultados foram analisados por análise de variância (ANOVA) e as médias foram comparadas pelo teste t de Student utilizando-se a média e desvio padrão.

Abstract: Macrofungi extract has been studied because of its great bioproducts variability. There are few studies about the antimicrobial potential of the mushroom Macrocybe titans. Microbial biofilm is the main virulence and resistance factor, and the research for new efficient therapeutic agents is an alternative against infectious disease. Candida species are the major causes of opportunistic and hospital infections, the most incident species are C. albicans and C. tropicalis. Thus, this work aims to elucidate the M. titans aqueous extract inhibition capacity over the yeast's biofilm formation. The aqueous extract was prepared through the powder maceration of basidiomes in purified water (1 g.mL-1). The antibiofilm activity through the violet crystal method, microscopic electronic array and the fluorescence microscopy (calcofluor white dye) were analyzed to investigate the cells and biofilm structural modifications after treatment, for biofilm formation and preformed biofilms. The virulence gene expression was evaluated through qRT-PCR. The primers used were C. albicans: UME6, CHT2 and ACT-1b; and C. tropicalis ALS1 and ACT1. The C. albicans and C. tropicalis biofilm formation was inhibited at 32 mg.mL-1 and 16 mg.mL-1, respectively, and preformed biofilms were inhibited at 63 mg.mL-1 and 8 mg.mL-1. The images showed scarcity of biofilm cells in the biofilm formation treatment, and voids appearance in the pre-formed biofilms. The yeast's cell walls showed uncharacteristic scars and deformation. The planktonic cells showed UME6 and CHT2 expressions inhibited in biofilm formation and preformed biofilms, as well as the sessile preformed biofilm cells. Although sessile biofilms formation cells showed increased expression (~20%). The ALS1 gene was less expressed in planktonic cells (~4 times) and more expressed in sessile cells (~1,5 to 2,5 times). The data was evaluated with ANOVA and Student T Tests.