Cultivo de trigo (Triticum aestivum var. Lini) in vitro na ausência de nitrogênio e presença de Herbaspirillum seropedicae : uma abordagem proteômica

Abstract

Resumo: O nitrogênio (N) é o principal determinante da produtividade para a cultura do trigo, sendo esse um dos maiores desafios da agricultura. O trigo está entre os cereais mais consumidos no mundo e sua produção no Brasil não atende a demanda nacional. A inoculação com bactérias promotoras de crescimento vegetal pode ser considerada uma ferramenta promissora na busca de uma agricultura sustentável e na diminuição de custos. Assim sendo, o objetivo deste estudo foi investigar proteínas presentes nas folhas de trigo das cultivares CD104 e CD120 quando inoculadas com a bactéria Herbaspirillum seropedicae para compreender a fisiologia da planta e do sistema fotossintético na ausência desse nutriente essencial ao seu desenvolvimento. Para obter as plantas em experimentos in vitro, sementes de trigo foram esterilizadas, pre-germinadas e transferidas para tubos de ensaio de vidro contendo meios de cultivo. Os controles experimentais, sem inóculo da bactéria, foram obtidos de plantas cultivadas no meio MS líquido sem (SN) e com (CN) fonte de nitrogênio. Após 24h, alguns tubos com meio SN receberam inóculo da bactéria (SNI) e todos os tubos foram mantidos em sala de cultivo a 24 °C e foto-período de 14 h de luz por 20 dias. Nenhum meio de cultura continha sacarose. As folhas foram tomadas para avaliar a massa seca e fresca, comprimento e produção de extrato de proteínas para realização de análise proteômica com base no fracionamento de proteínas por SDS-PAGE seguida de LC-MS/MS, tipo Q-TOF. Plantas intactas foram usadas para obtenção de índice de nitrogênio (NBI), clorofila (CHL), flavonoides, antocianinas e fluorescência da clorofila. As proteínas identificadas foram divididas de acordo com função em componentes celulares, processos biológicos e funções moleculares. A partir dos resultados, foi possível observar para as folhas da cv. CD120 que a bactéria promoveu incremento de NBI e CHL, e reduziu antocianinas. Houve também redução na extinção fotoquímica e não-fotoquímica a partir dos dados de fluorescência da clorofila. E apenas uma proteína foi identificada exclusivamente no tratamento SNI, sendo atribuída à proteção do fotossistema II (PSII). Enquanto as folhas da cv. CD104 obtidas do meio SNI, 5 proteínas foram relacionadas a fotossíntese e outras proteínas sugerem relação com respostas de hipersensibilidade e resistência a doenças em plantas, como a beta-1,3-glucanase. Ambas as cultivares, na ausência de nitrogênio (SN), apresentaram proteínas relacionadas ao metabolismo antioxidante, dentre elas a glutationa S-transferase. Os resultados sugerem que a ausência de nitrogênio é promotora de estresse nas plantas de trigo de ambas cultivares, porém a cv. CD120 é mais tolerante. É possível concluir que a interação com a bactéria H. seropedicae é genótipo dependente e que a presença da bactéria no meio induziu nas plantas diferentes respostas para mitigação do estresse da ausência de nitrogênio, sendo que para a cv. CD104 promoveu tolerância e a cv. CD120 obteve nitrogênio pela interação com a bactéria.

Abstract: Nitrogen (N) is the main determinant of wheat crop productivity, which is one of the biggest challenges in agriculture. Wheat is the most consumed cereal in the world and its production is not enough to meet consumption in Brazil. Inoculation with plant growthpromoting bacteria can be a promising tool in the search for sustainable agriculture and cost reduction. Therefore, the objective of this study was to investigate proteins present in the wheat leaves of cultivars CD104 and CD120 when inoculated with a diazotrophic bacteria Herbaspirillu seropedicae to understand the plant and photosynthetic system physiology in the absence of this essential nutrient for its development. To obtain the plants in vitro experiments, wheat seeds were sterilized, pre-germinated and transferred to glass test tubes containing medium. The experimental controls, without bacterial inoculum, were obtained from plants grown in MS liquid medium without (SN) and with (CN) nitrogen source. After 24h, some tubes of SN medium received bacterial inoculum (SNI) and all tubes were kept in a culture room at 24 °C and a 14-hour photoperiod of light for 20 days. Sucrose was not added to mediuns. Leaves were harvested to evaluate dry and fresh mass, length, and production of protein extract for proteomics based on protein fractionation by SDS-PAGE followed by LCMS / MS, type Q-TOF. Intact plants were used to obtain nitrogen index (NBI) and chlorophyll (CHL), flavonoids and anthocyanins, chlorophyll fluorescence. The identified proteins were distributed in different cellular components, biological processes, and molecular functions. From the results it was possible to observe the bacterium promoted the increase of NBI and CHL, reduced anthocyanins in leaves of cv. CD120 and the chlorophyll fluorescence data shown reduction in photochemical and non-photochemical extinction too. Only one protein was uniquely at this condition and it is attributed to protection of photosystem II (PSII). While the leaves of cv. CD104 from the SNI medium were observed 5 proteins related to photosynthesis and other proteins to hypersensitivity and diseases resistance responses, such as beta-1,3- glucanase. Both cultivars in the absence of nitrogen (SN) presented proteins related to antioxidant metabolism, among them glutathione S-transferase, although chlorophyll fluorescence data were not severely affected, proteomic data indicated cv. CD120 is more tolerant to nitrogen absence. It is possible to conclude interaction with the bacterium H. seropedicae is plant-genotype dependent and the presence of the bacteria is inducing different responses to mitigate plant stress in the medium without nintrogen source.There is evidence to conclude that cv. CD104 is achiving tolerance and cv. CD120 is obtaining nitrogen from interaction with the bacterium.