Análise do potencial antifúngico do extrato de Macrocybe titans sobre Candida albicans

Abstract

Resumo: Extratos de macrofungos têm sido estudados devido à grande variedade de seus bioprodutos. O cogumelo basidiomicete Macrocybe titans foi recentemente relatado no Brasil e existem poucos registros na literatura sobre o seu potencial antimicrobiano. Com o rápido surgimento de resistência de microrganismos aos antibióticos, a busca por novos agentes terapêuticos eficazes tem se tornado uma alternativa favorável no combate às doenças causadas por fungos, principalmente espécies de Candida. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivos verificar o potencial antifúngico de extratos de M. titans sobre Candida albicans ATCC 90028, bem como os efeitos nos aspectos morfológicos dessa levedura. Foram utilizados cinco extratos obtidos de M. titans, sendo três frações aquosas (concentrada, filtradas EfraMat-45 e EfraMat-22 - valores em ?m referentes à porosidade do filtro); extratos metanólico/acetato de etila a frio; extratos metanólico/acetato de etila a quente (Soxhlet). A susceptibilidade antifúngica foi avaliada por microdiluição em caldo e disco-difusão, de acordo com os protocolos do CLSI M27-A3 e M44-A2. Foi verificado que EfraMat-45 apresentou a melhor Concentração Inibitória Mínima entre os extratos (31,25 ?g/?l). Os aspectos micromorfológicos foram analisados por microcultivo em ágar-fubá com Tween 80 (1%), Microscopia de Fluorescência utilizando Calcofluor White e iodeto de propídio, e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Na análise por microcultivo foi possível observar completa inibição do crescimento da levedura nas lâminas referentes à concentração CIM, em todos os extratos aquosos de M. titans. Alterações morfológicas foram observadas nas lâminas de sub-CIM, ocorrendo maior formação de células alongadas e ausência de clamidósporos, comparando-se com as leveduras controle. Através da MEV, foi possível observar alterações morfológicas e danos sutis na superfície da estrutura das células tratadas com o EfraMat-45 na concentração CIM. A Microscopia de Fluorescência em células de C. albicans coradas com Calcofluor White evidenciou a presença de estruturas alongadas quando as células foram cultivadas em meio líquido com EfraMat-45 na concentração de CIM. A coloração por iodeto de propídio evidenciou morte celular nas leveduras tratadas com o extrato. Foi verificado que o EfraMat-45 apresentou elevada taxa de compostos fenólicos e flavonoides, atividade antioxidante e ausência de citotoxicidade in vitro. Por fim, os resultados permitiram afirmar que o extrato aquoso de M. titans apresentou comportamento bastante promissor no que diz respeito à ação antifúngica, com alterações celulares certificando a morte celular, sendo necessária a continuação do estudo de purificação e elucidação estrutural dos compostos presentes, a fim de verificar se a ação antifúngica encontrada poderá ser atribuída a um composto específico ou depende de algum mecanismo sinérgico de compostos secundários.

Abstract: Macrofungi extracts have been studied due to the wide variety of their bioproducts. The basidiomycete mushroom Macrocybe titans was recently reported in Brazil and there are few reports in the literature about its antimicrobial potential. With the rapid emergence of antibiotics resistant microorganisms, the search for new effective therapeutic agents has become a favorable alternative in the fight against diseases caused by fungi, mainly Candida species. Thus, the present study aimed to verify the antifungal potential of M. titans extracts on Candida albicans ATCC 90028, as well as the effects on the morphological aspects of this yeast. Were used five extracts obtained from M. titans: three aqueous fractions (concentrated, filtered EfraMat-45 and EfraMat-22 - values in ?m related to filter porosity); methanolic/ethyl acetate extracts (cold method); methanolic/ethyl acetate extracts (hot Soxhlet extraction method). The antifungal susceptibility was evaluated by broth microdilution and disk-diffusion method, according to CLSI's M27-A3 and M44-A2 protocols. It was found that EfraMat-45 showed the best results for Minimum Inhibitory Concentration (31.25 ?g/?l) among extracts. Micromorphological aspects were analyzed by microculture on cornmeal agar supplemented with 1% Tween 80, Fluorescence Microscopy using Calcofluor White and propidium iodide, and Scanning Electron Microscopy (SEM). In the microculture analysis, it was possible to observe complete inhibition of yeast growth on the culture slides referring to MIC, in all aqueous extract of M. titans. Morphological changes were observed on the slides of sub-MIC, with an increased formation of elongated cells and chlamydospores absence, compared to control yeasts. Through SEM, it was possible to observe morphological changes and slight damages on the surface of cells treated with EfraMat-45 MIC. Staining with Calcofluor White revealed the presence of elongated cells in C. albicans cultivated with EfraMat-45 at MIC in liquid medium. Propidium iodide staining revealed cell death on yeasts treated with the extract. It was verified that EfraMat-45 showed higher rates of phenolic and flavonoid compounds, antioxidant activity, and absence of in vitro cytotoxicity. Finally, the results suggest that the aqueous extract of M. titans showed a very promising pattern as regarded to antifungal action, with cellular changes certifying cell death, requiring a further study of purification and structural elucidation of the compounds, in order to verify whether the antifungal effect can be attributed to a specific compound or it depends on some synergistic mechanism of secondary compounds.