Padronização e aplicação de metodologias moleculares para avaliar o efeito da temperatura e pH na expressão da vitelogenina metalotioneína em Danio rerio

Abstract

Resumo: Os estudos de qualidade de água são um grande desafio para a manutenção dos ambientes naturais e da biodiversidade, e as buscas por novas ferramentas são necessárias para atender a essa demanda ambiental. As proteínas metalotioneína (MT) e vitelogenina (VTG) são dois importantes biomarcadores de exposição a poluentes, expressas em peixes quando expostos a metais tóxicos e substâncias estrogênicas, respectivamente. Para investigar se alterações nos parâmetros físicos e químicos interferem na expressão dessas proteínas, e validar sua posterior utilização em biomonitoramento ambiental, exemplares adultos de Danio rerio foram mantidos em laboratório sob diferentes temperaturas e pHs, por 4d, 10d, 15d e 20d. Após a exposição, os espécimes foram eutanasiados e preservados a -80oC, homogeneizados e o extrato centrifugado e preservado para análises posteriores. A concentração de proteínas totais foi estimada por espectofotometria, a 280nm. Frações solúveis resultantes do homogenato foram analisadas pelo ensaio de ELISA quantitativo. Análises de expressão gênica foram realizadas por rt-qPCR, utilizando oligonucleotídeos iniciadores gerados com base na sequência nucleotídica das proteínas MT e VTG de D. rerio, obtidas no GenBank. A expressão dos genes endógenos Fator de Alongamento e Carreador de Soluto 25? foram utilizadas para normalizar os dados, através do método delta-delta Ct. Os resultados foram analisados estatisticamente para determinar se esses fatores físicos e químicos interferem nesses biomarcadores, permitindo uma melhor interpretação de avaliações da qualidade da água com base em seu uso. Nos ensaios de ELISA, não foram constatadas diferenças significativas na concentração de VTG em nenhum dos tratamentos; em relação à proteína MT também não foram observadas diferenças significativas em relação às diferentes temperaturas testadas. Entretanto, os grupos submetidos a pH extremos (9,0 e 5,0) mostraram diferenças significativas no conteúdo de MT em relação ao grupo controle nos dias 10 e 15 de exposição, recuperando os valores no 20º dia de exposição. A expressão gênica de ambas as proteínas também não mostrou diferenças significativas entre os tratamentos para machos e fêmeas (exceto machos submetidos aos pHs ao 20º dia, que diminuíram sua expressão de MT). Já entre machos e fêmeas, os únicos grupos que se mostraram diferentes foram as fêmeas submetidas à 25ºC e a pH 5,0, para VTG, em relação aos machos controle destes tratamentos. Através destes resultados pode-se concluir que essas proteínas constituem biomarcadores confiáveis em D. rerio, uma vez que não aumentam sua expressão gênica ou proteica com a variação da temperatura e pH testados. Palavras Chaves: biomarcadores, imunodetecção, parâmetros físicos e químicos, bioensaios, peixe-zebra.

Abstract: Water quality studies are a major challenge for the maintenance of natural environments and biodiversity, and searches for new tools are needed to attend this environmental demand. The proteins metallothionein (MT) and vitellogenin (VTG) are two important biomarkers of exposure to pollutants, expressed in fish when exposed to toxic metals and estrogenic substances, respectively. To investigate whether changes in physical and chemical parameters interfere with the expression of these proteins, and validate its subsequent use in environmental biomonitoring, adult specimens of Danio rerio were kept in the laboratory under different temperatures and pHs, for 4d, 10d, 15d and 20d. After exposure, the specimens were euthanized and preserved at -80ºC, homogenized and the extract was centrifuged and preserved for further analysis. The concentration of total proteins was estimated by spectrophotometry, at 280nm. Soluble fractions resulting from the homogenate were analyzed by the quantitative ELISA assay. Gene expression analysis were performed by rt-qPCR, using primers generated based on the nucleotide sequence of the MT and VTG proteins of D. rerio, obtained from GenBank. The expression of the endogenous Stretching Factor and Solute Carrier 25? genes were used to normalize the data, using the delta-delta Ct method. The results were analyzed statistically to determine whether these physical and chemical factors interfere with these biomarkers, allowing a better interpretation of water quality assessments based on their use. In the ELISA assays, no significant differences were found in the concentration of VTG in any of the treatments; in relation to the MT protein, no significant differences were also observed in relation to the different temperatures tested. However, the groups submitted to extreme pH 9.0 and 5.0 showed significant differences in the MT content in relation to the control group on days 10 and 15 of exposure, recovering the values on the 20th day of exposure. Gene expression of both proteins also showed no significant differences between treatments for males and females (except males submitted to pHs on the 20th day, which decreased their MT expression). Among males and females, the only groups that were different were females submitted to 25ºC and pH 5.0, about VTG, in relation to the control males of these treatments. Through these results it can be concluded that these proteins are reliable biomarkers in D. rerio, since they do not increase their gene or protein expression with the tested temperature and pH variation. Keywords: biomarkers, immunodetection, physical and chemical parameters, bioassays, zebrafish.