Análise comparativa da expressão de HLA-G em células-tronco mesenquimais de diferentes fontes

Abstract

Resumo: Introdução: As células-tronco mesenquimais (CTMs) vêm sendo utilizadas na terapia celular devido aos seus efeitos terapêuticos já estabelecidos. Podem ser isoladas a partir de diferentes tecidos, sendo os principais a medula óssea (MO), tecido do cordão umbilical (TCU), tecido adiposo (TA) e polpa dentária (PD). Por causa de suas características imunomoduladoras, são uma opção em potencial para a terapia imunossupressora. Embora a modulação da resposta imune pelas CTMs seja resultado de diversos fatores, a molécula HLA-G parece desempenhar um papel chave neste efeito. A expressão do HLA-G é capaz de inibir a proliferação de células T, B, NKs e monócitos e induzir a ativação de células Treg modulando a resposta imune do hospedeiro. Diante disso, a identificação de uma fonte de CTMs com maior expressão de HLAG pode ser uma boa estratégia para futuros tratamentos. Metodologia: Foram utilizadas três amostras de CTMs do TCU, do TA, da PD e uma amostra de MO como controle. As células foram cultivadas sob três formas: (i) cultivo padrão, com meio de cultivo suplementado com 20% de Soro Bovino Fetal e antibióticos; (ii) cultivo sob estímulo de interferon-y (IFN-y); e (iii) cultivo sob condição de hipóxia (O2 2%). Após a obtenção do número necessário de células, que ocorreu nas passagens de número P5 a P7, foi analisada a expressão dos marcadores CD14, CD73, CD34, CD19, CD166, CD29, CD45, CD90, HLA-DR e CD105, característicos de CTMs. Concomitantemente, foi feita a análise de marcadores co-estimulatórios CD40, CD80 e CD86. Para estudar a expressão de moléculas imunossupressoras, a análise da molécula CD152 (isoforma intracelular) e da isoforma HLA-G1 de membrana foi feita por citometria de fluxo. Para análise da isoforma solúvel HLA-G5 expressa no sobrenadante dos cultivos foram realizados os ensaios de ELISAPara a análise do potencial imunossupressor das CTMs, foi realizado o ensaio de inibição de linfócitos. CTMs foram cultivadas durante cinco dias com células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) nas proporções CTM:PBMC = 1:2; 1:5; e 1:10. Para determinar o impacto de polimorfismos presentes no gene HLA-G na expressão da proteína HLA-G, foi analisada a sequência dos éxons 1 a 5 e da região regulatória 3'UTR. Resultados e Discussão: A expressão dos marcadores celulares esteve de acordo com o exigido pela International Society for Cell and Gene Therapy. Todas as amostras foram consideradas negativas para a expressão de marcadores co-estimulatórios CD40, CD80 e CD86 e positivas para o CD152, independente da forma de cultivo. Quando cultivadas sob condição padrão de cultivo, CTMs do TCU expressaram 5,53x mais CD152 do que CTMs da PD (p=0,0164), e também expressaram HLA-G1 e HLA-G5 em níveis significativamente maiores (p=0,0287 e p=0,0001). A análise do potencial inibitório das CTMs permitiu observar que todas as fontes de CTMs foram capazes de inibir a proliferação das células imunes. Não foi observada diferença no percentual de inibição entre as fontes, com exceção das CTMs estimuladas com IFN-y, cultivadas na proporção 1:2 (p=0,0153), onde as CTMs do TCU apresentaram potencial inibitório significativamente menor em relação as CTMs da PD (p=0,0156). Quando agrupados de acordo com o tratamento, não foi observada diferença no potencial imunomodulador das CTMs. As amostras que apresentaram o alelo HLA-G*01:04:01:01 inibiram as células imunes em níveis significativamente maiores (p=0,0003) em relação a amostra que não apresentou este alelo. Conclusão: O alelo HLA-G*01:04:01:01 parece conferir um maior potencial inibitório às CTMs e embora as três fontes se mostrarem alternativas eficientes a MO, o TCU apresentou vantagem em relação a expressão de moléculas imunossupressoras HLA-G e CD152, demonstrando ser a fonte mais promissora.

Abstract: Introduction: Mesenchymal stem cells (CTMs) have been used in cell therapy due to their already established therapeutic effects. They can be isolated from different tissues, the main ones being bone marrow (MO), umbilical cord tissue (TCU), adipose tissue (TA) and dental pulp (PD). Because of their immunomodulatory characteristics, they are a potential option for immunosuppressive therapy. Although the modulation of the immune response by MSCs is the result of several factors, the HLA-G molecule appears to play a key role in this effect. The expression of HLA-G is able to inhibit the proliferation of T cells, B, NKs and monocytes and induce the activation of Treg modulating cells by immune host response. Therefore, the identification of a source of MSCs with greater HLA-G expression can be a good strategy for future treatments. Methodology: Three samples of CTMs from TCU, TA, PD and a sample of MO were used as a control. The cells were grown in three forms: (i) standard culture, with culture medium supplemented with 20% Bovine Fetal Serum and antibiotics; (ii) cultivation under interferon-y (IFN-y) stimulation; and (iii) cultivation under hypoxia condition (2% O2). After obtaining the necessary number of cells, which occurred in passages number P5 to P7, the expression of the markers CD14, CD73, CD34, CD19, CD166, CD29, CD45, CD90, HLADR and CD105, characteristic of CTMs, was analyzed . Concomitantly, co-stimulatory markers CD40, CD80 and CD86 were analyzed. To study the expression of immunosuppressive molecules, the analysis of the CD152 molecule (intracellular isoform) and the membrane HLAG1 isoform was performed by flow cytometry. For analysis of the soluble HLA-G5 isoform expressed in the supernatant of the cultures, ELISA assays were performed. For the analysis of the immunosuppressive potential of MSCs, the lymphocyte inhibition assay was performed. CTMs were cultured for five days with peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in the proportions CTM:PBMC = 1:2; 1:5; and 1:10. To determine the impact of polymorphisms present in the HLA-G gene on the expression of the HLA-G protein, the sequence of exons 1 to 5 and the regulatory region 3'UTR was analyzed. Results and Discussion: The expression of cellular markers was in accordance with that required by the International Society for Cell and Gene Therapy. All samples were considered negative for the expression of co-stimulatory markers CD40, CD80 and CD86 and positive for CD152, regardless of the culture method. When grown under standard culture conditions, TCU CTMs expressed 5.53x more CD152 than PD CTMs (p=0,0164), and also expressed HLA-G1 and HLA-G5 at significantly higher levels (p=0,0287 and p=0,0001). The analysis of the inhibitory potential of MSCs allowed to observe that all sources of MSCs were able to inhibit the proliferation of immune cells. No difference was observed in the percentage of inhibition between the sources, with the exception of CTMs stimulated with IFN-y, grown in the proportion 1: 2 (p=0,0153), where the CTMs of TCU showed significantly lower inhibitory potential in relation to CTMs of the PD (p=0,0156). When grouped according to treatment, there was no difference in the immunomodulatory potential of MSCs. The samples that presented the HLA-G * allele 01: 04: 01: 01 inhibited the immune cells at significantly higher levels (p=0,0003) in relation to the sample that did not present this allele. Conclusion: The HLA-G*01:04:01:01 allele seems to confer a greater inhibitory potential to MSCs and although the three sources prove to be efficient alternatives to MO, TCU showed an advantage in relation to the expression of HLA-G and immunosuppressive molecules CD152, proving to be the most promising source.