Identificação de genes de Phaseolus vulgaris envolvidos na resposta a proteínas de nodulação (NOPS) de Sinorhizobium fredii NGR234

Abstract

Resumo: A fixação biológica de nitrogênio é o processo onde ocorre a conversão de nitrogênio gasoso em amônia através da atividade do complexo enzimático da nitrogenase presente em bactérias diazotróficas. Sinorhizobium fredii NGR234 é uma bactéria capaz de fixar nitrogênio no interior de estruturas conhecidas como nódulos, e apresenta um sistema de secreção tipo III que secreta cinco proteínas efetoras (NopM, NopJ, NopT, NopP e NopL). Estas proteínas provocam modificações na célula vegetal e determinam a eficiência de nodulação de diferentes maneiras dependendo da planta hospedeira. Phaseolus vulgaris (feijão comum) é uma leguminosa com grande importância na alimentação nos países da América Latina e África. O feijão pode se associar a S. fredii NGR234 e formar nódulos na raiz, onde ocorre a fixação de nitrogênio. Nesta associação, o sistema de secreção de S. fredii NGR234 tem efeito negativo na nodulação de P. vulgaris. O processo de nodulação depende do reconhecimento planta-bactéria e envolve uma cascata com várias etapas, incluindo a secreção de flavonóides pelas raízes da planta e a produção de fatores Nod, polissacarídeos e proteínas efetoras (Nops) pela bactéria. Pouco se conhece sobre os aspectos moleculares do reconhecimento das proteínas Nops pela da planta. Assim, este trabalho teve como objetivo identificar os genes de P. vulgaris diferencialmente expressos em resposta aos Nops de S. fredii NGR234, como também as vias metabólicas em que eles estão envolvidos. Para tanto, o transcriptoma de P. vulgaris inoculado com as estirpes selvagem NGR234 e mutantes nopM-, nopJ- e rhcN- foi analisado. As amostras de RNA foram obtidas em duas fases de desenvolvimento do nódulo, com 10 dias (primórdio) e 21 dias (nódulo). As bibliotecas de cDNA foram sequenciadas, os reads gerados foram mapeados no genoma de P. vulgaris e os genes foram comparados entre as condições testadas (NGR234 vs nopJ-, NGR234 vs nopM-, NGR234 vs rhcN, rhcN- vs nopJ-, rhcNvs nopM- e nopJ- vs nopM-) para primórdio e nódulo. Os genes considerados diferencialmente expressos entre as condições (valor de p ? 0.05 e fold-change ? 2) foram categorizados quanto a função no programa Mapman v 3.5.1. Os resultados sugerem que os Nops translocados pelo sistema de secreção tipo III de NGR234 no citoplasma de P. vulgaris ativam a transcrição de vários genes envolvidos na defesa da planta e resposta ao estresse.

Abstract: Biological nitrogen fixation is the process of dinitrogen conversion into ammonia through the activity of the nitrogenase enzyme complex present in diazotrophic bacteria. Sinorhizobium fredii NGR234 is a bacterium capable of fixing nitrogen inside structures known as nodules, and presents a type III secretion system that secretes five effector proteins (NopM, NopJ, NopT, NopP and NopL). These proteins cause modifications in the plant cell physiology and determine nodulation efficiency in different ways depending on the host plant. Phaseolus vulgaris (common bean) is a legume of great importance for food in Latin America and Africa countries. Beans can associate with S. fredii NGR234 and form nodules in the root where nitrogen fixation occurs. In this association, the S. fredii NGR234 secretion system has a negative effect on P. vulgaris nodulation. The nodulation process depends on the plant-bacteria recognition and involves a cascade of many steps, including flavonoids secretion by plant roots and the production of Nod factors, polysaccharides and effector proteins (Nops) by the bacteria. The molecular aspects of Nops recognition by the host are poorly known. Thus, this work aimed to identify the P. vulgaris genes differentially expressed in response to S. fredii NGR234 Nops, as well as the metabolic pathways in which they are involved. For this, the P. vulgaris transcriptome after inoculation with NGR234 wild-type strain and nopM-, nopJ- and rhcN- mutants was analysed. RNA samples were obtained in two phases of nodule development, 10 days (primordia) and 21 days (nodule). cDNA libraries were sequenced and the reads obtained were mapped into the P. vulgaris genome. The genes were compared between the conditions tested (NGR234 vs nopJ-, NGR234 vs nopM-, NGR234 vs rhcN-, rhcN- vs nopJ-, rhcN - vs nopM- and nopJvs nopM-) for primordia and nodule samples. Genes differentially expressed between conditions (p value ? 0.05 and fold change ? 2) were categorized by function in the Mapman v 3.5.1 program. The results suggest that Nops translocated by the NGR234 type III secretion system in the P. vulgaris cytoplasm activate the transcription of several genes involved in plant defense and stress response.