Propagação in vitro de Cattleya warneri T. Moore : efeito da microalga Desmodesmus subspicatus (Chodat) E. Hegewald & A.W.F. Schmidt, das poliaminas e dos reguladores de crescimento vegetal
Resumo
Resumo:Cattleya warneri pertence à família Orchidaceae e é uma espécie epífita, endêmica da Mata Atlântica, que apresenta alto potencial ornamental. A germinação de sementes na natureza é muito difícil, pois são microscópicas, não apresentam endosperma e dependem de fungos micorrízicos específicos para germinar. Em função dessas características reprodutivas, a germinação assimbiótica ou in vitro de orquídeas é uma alternativa eficiente para produção de mudas e conservação de espécies. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da microalga Desmodesmus subspicatus na germinação assimbiótica e também das poliaminas e de reguladores de crescimento vegetais na micropropagação, utilizando a técnica "thin cell layer" (TCL) para a produção de mudas em grande escala de Cattleya warneri. Sementes foram germinadas em meio de cultura MS, com a concentração de macronutrientes reduzida pela metade (MSM/2), suplementado com: 0; 0,25; 0,5; 1,0 e 2,0 g L-1 de biomassa ou de extrato aquoso de D. subspicatus. A adição de biomassa ou extrato (0,25 g L-1) da microalga acelerou a germinação. Após 24 semanas da semeadura foram observadas altas porcentagens de formação de plântulas (superior a 90%) em todos os tratamentos com biomassa e com adição de 0; 0,25 e 0,5 g L-1 de extrato. O meio MSM/2, semi-sólido, com adição de 2,0 g L-1 de carvão ativado foi recomendado para induzir alongamento e desenvolvimento de raízes. O cultivo de explantes em meio dupla-fase (fina camada de meio líquido, contendo 0,5 a 2 g L-1 de extrato sobre o meio semi-sólido) possibilitou um aumento no número de brotos devido a presença de zeatina na composição do extrato. A aclimatização de mudas utilizando esfagno como substrato foi eficiente (superior a 80% de sobrevivência), recomendando-se pulverização por quatro meses com 2 g L-1 de biomassa ou 1 g L-1 de extrato da microalga. Protocormos (90 a 120 dias) obtidos da germinação in vitro em meio MSM/2 foram utilizados como explantes para os experimentos de TCL. Secções transversais (TCLts) apicais e basais e longitudinais (TCLls) foram comparadas com protocormos inteiros. Foram avaliados os efeitos dos reguladores de crescimento vegetais: 6-benzilaminopurina (BAP: 0; 4; 8 ou 16 ?M) combinado com ácido ?-naftaleno acético (ANA: 0; 2 e 4 ?M); das poliaminas (PAs): putrescina (Put), espermidina (Spd) e espermina (Spm) (0; 0,25; 0,5; 1,0 e 1,5 mM) e da biomassa ou extrato de D. subspicatus (0; 0,25 0,5; 1,0 e 2,0 g L-1) na indução e regeneração de estruturas semelhantes à protocormos (ESPs). Os explantes obtidos da técnica TCL foram cultivados em meio MSM/2, contendo carvão ativado (0, 1, 2 e 4 g L-1) para estimular o alongamento e desenvolvimento de raízes. As mudas foram transplantadas em bandejas de semeadura, com diferentes substratos: esfagno, vermiculita, casca de pinus, carvão vegetal, fibra de coco, Maxfertil® e Forth®. Os resultados indicaram que os TCLts apicais foram os explantes mais responsivos nos meios contendo reguladores vegetais, PAs e microalgas. Os protocormos inteiros foram eficientes para a regeneração de plantas. As melhores respostas de regeneração de ESPs ocorreram com adição de 8 ?M de BAP (89,58% e 5,2 ESPs); com 0,75 mM de Spd (100% e 2,3 ESPs) e com 1,5 g L-1 de biomassa (92% e 4,7 ESPs) ou 1,0 g L-1 do extrato (100% e 3,3 ESPS) da microalga no meio de cultura MSM/2. A adição de biomassa ou extrato de D. subspicatus no meio de cultura pode substituir os reguladores do crescimento vegetais clássicos (BAP e ANA) na indução e regeneração de ESPs. Protocormos inteiros também podem ser utilizados na técnica TCLt apical, com adição de 1,0 g L-1 de biomassa (70% e 4,0 ESPs). A adição de 3 g L-1 de carvão ativado é recomendada para promover alongamento da parte aérea e enraizamento. As plantas foram aclimatizadas com sucesso (porcentagem de sobrevivência maior de 80%) em todos os substratos testados, após 120 dias em casa de vegetação. Foi desenvolvido um protocolo completo e eficiente de germinação assimbiótica, de desenvolvimento de plântulas e de micropropagação utilizando a técnica TCL, a partir de protocormos, com o uso de reguladores do crescimento vegetais, PAs e biomassa ou extrato da microalga D. subspicatus que permitiu a propagação massal de plantas de C. warneri. Palavras-chave: Bioestimulante. Germinação assimbiótica. Orquídea epífita. Micropropagação. "Thin cell layer". Abstract: Cattleya warneri belongs to the Orchidaceae family and is an epiphytic species, endemic to the Atlantic Forest of Brazil, with high ornamental potential. Seed germination in nature is very difficult, as seeds are microscopic, have no endosperm and depend on specific mycorrhizal fungi to germinate. As a result of these reproductive characteristics, asymbiotic or in vitro germination of orchids is an efficient alternative for seedling production and species conservation. The aim of this study was to evaluate the effect of Desmodesmus subspicatus microalga on asymbiotic germination as well as polyamines (PAs) and plant growth regulators (PGRs) on micropropagation, using the thin cell layer (TCL) technique for large-scale production of Cattleya warneri seedlings. Seeds were germinated in MS culture medium, with the macronutrient concentration reduced by half (MSM/2) and supplemented with 0, 0.25, 0.5, 1.0 and 2.0 g L-1 of D. subspicatus biomass or aqueous extract. The addition of 0.25 g L-1 microalga biomass or extract accelerated the germination. After 24 weeks of sowing, high percentages of seedling formation (greater than 90%) were achieved in all treatments containing biomass and with 0, 0.25, 0.5 g L-1 of the extract. Elongation and root development were induced in semisolid MSM/2 medium, supplemented with 2.0 g L-1 of activated charcoal. The shoot number of explants cultivated in a double-phase medium (a thin layer of liquid medium, containing 0.5 to 2 g L-1 of extract, above the semi-solid medium) was increased due to the presence of zeatin in the extract composition. The seedlings were successfully acclimatized (with a survival rate greater than 80%) using sphagnum as a substrate, followed by foliar sprays with 2 g L-1 of biomass or 1 g L-1 of microalga extract for four months. Protocorms (90 to 120 days) from in vitro germination cultivated in MSM/2 medium were used as explants for the TCL experiments. Apical and basal transverse sections (tTCLs), longitudinal sections (lTCLs) and entire protocorms were compared. The effects of PGRs (0, 4, 8 or 16 ?M 6-benzylaminopurine - BAP, combined with 0, 2 and 4 ?M naphthalene acetic acid - NAA), of PAs: putrescine (Put), spermidine (Spd) and spermine (Spm) (0, 0.25, 0.5, 1.0 and 1.5 mM) and of D. subspicatus biomass or extract (0, 0.25, 0.5, 1.0 and 2.0 g L-1) on protocorm-like bodies (PLBs) regeneration were evaluated. The explants were transferred to MSM/2 medium supplemented with activated charcoal (0, 1, 2 and 4 g L-1) to induce elongation and root development. The seedlings were transplanted into sowing trays, with different substrates: sphagnum, vermiculite, pine bark, charcoal, coconut fiber, and Maxfertil® or Forth®. The apical tTCLs cultivated in a medium supplemented with PGRs, PAs and microalgae were the most responsive explants. Entire protocorms were efficient for plant regeneration. The best responses of PLB regeneration were achieved with the addition of 8 ?M BAP (89.58% and 5.2 PLBs), 0.75 mM Spd (100% and 2.3 PLBs),1.5 g L-1 of biomass (92% and 4.7 PLBs) or 1.0 g L-1 of microalgae extract (100% and 3.3 PLBs) into the MSM/2 culture medium. The addition of microalga extract or biomass to the medium can replace the addition of conventional PGRs for PLB induction and regeneration. Entire protocorms can also be used in the apical tTCL technique, adding 1.0 g L-1 of biomass (70% and 4.0 PLBs) to the medium. The activated charcoal (3 g L-1) is recommended to induce elongation and rooting, and the plants were successfully acclimatized (survival rate higher than 80%) in all tested substrates, after 120 days in the greenhouse. A complete and efficient protocol for asymbiotic germination, seedling development and micropropagation, applying the TCL technique for protocorms, was achieved adding PGRs, PAs or microalga into the MSM/2 culture medium resulting in mass propagation of C. warneri plants. Keywords: Bioestimulant. Asymbiotic germination. Epiphytic orchids. Micropropagation. Thin cell layer.
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