A distribuição da inervação imunorreativa ao peptídeo cart na zona ventricular-subventricular

Abstract

Resumo: O transcrito regulado pela cocaína e anfetamina (CART) é um neuropeptídeo com ampla presença no sistema nervoso central (SNC) de mamíferos. Com a identificação e o mapeamento de sua distribuição, houve um grande interesse sobre sua função e mecanismo de ação nos diferentes núcleos e áreas onde o CART era descrito. A localização de corpos neuronais e/ou fibras axonais imunorreativas (ir) ao CART em regiões dos sistemas límbico, sensoriomotor e vegetativo sugerem uma participação em funções locais específicas e enfatizam sua complexidade e ação como agente regulador. Evidências apontam diversas funções para esse peptídeo como modulador de comportamentos e ações como: estresse e ansiedade, alimentação, cognição, dependência química, desenvolvimento e proliferação neural. Em relação às duas últimas características, sabe-se que a região da zona ventricularsubventricular (V-SVZ) do ventrículo lateral é inervada por axônios ir-CART e exibe diferentes populações de precursores neurais remanescentes do período embrionário, os quais se mantém ativos durante toda a vida. Com isto, objetivamos mapear os axônios ir-CART e quantificar sua distribuição neuroanatômica na V-SVZ, analisando possíveis sinapses ou aposições entre os terminais ir-CART e as células da região. Utilizamos encéfalos previamente preparados e removidos de ratos adultos machos da linhagem Long-Evans, sob protocolo aprovado pelo comitê de ética em pesquisa de acordo com o CONCEA. As amostras foram submetidas a protocolos de marcação imunoistoquímica simples ou duplas, por métodos de peroxidase ou fluorescência, utilizando-se anticorpos anti-CART, anti-DARPP32 e antivimentina, sob concentrações específicas. As quantificações da marcação anti- CART utilizaram dados de conversão em pixels fornecidos pelo plugin FeatureJ do programa ImageJ, seguindo protocolo adaptado e validado que demonstraram ser uma quantificação semi-automática eficiente. Encontramos a maior densidade de inervação ir-CART nos territórios medial e ventral da VSVZ, cujas médias densitométricas foram de 5 a 10 vezes maiores comparado aos territórios lateral e dorsolateral ao longo do eixo anteroposterior, além da presença de aposições entre terminais ir-CART, células ependimárias e estriatais imunomarcadas por DARPP32. Com isso, oferecemos uma abordagem neuroanatômica que amplia dados funcionais e fisiológicos da ação do CART relacionada a uma possível formação de novos neurônios dentro do território da SVZ. Palavras-chave: neurogênese; axônio; imunoistoquímica.

Abstract: The cocaine and amphetamine regulated transcript (CART) is a neuropeptide with a wide presence on mammal central nervous system (CNS), distributed all over the neuroaxis. This feature drew a huge interest over its function and mechanism of action on different nuclei and areas where it was described. The localization of neuron cell bodies and/or immunoreactive (ir) CART fibers on regions of the limbic, motor, vegetative and sensory systems suggest its participation on specific local functions, thereby it highlights CART complexity and variability as a regulator agent. Evidences point out several functions for this peptide as a modulator of behavior and actions such as: stress and anxiety, feeding, cognition, drug addiction, neural development and proliferation. Regarding of the last two features, it is known that the ventricular/ subventricular zone (V-SVZ) of the lateral ventricle is innervated by immunoreactive (ir)-CART axons and exhibit different populations of reminiscent neural precursors from the embryonic stage, which are kept active throughout the entire lifetime. Thus we objective to track the ir-CART fibers and quantify its neuroanatomic distribution on the V-SVZ, in order to analyze feasible synapses or appositions between the ir-CART terminals and local cells. We used brains previously prepared and removed from adult male Long-Evans rats, under approved protocol by the ethics committee according to CONCEA legislation. The samples were submitted to single and double immunostaining protocols using fluorescence and peroxidase techniques whereas anti-CART, anti- DARPP32 and anti-Vimentin antibodies were used under specific concentrations. The data obtained for the quantification of ir-CART immunostaining was given in pixel units, measured after application of the hessian filter found on FeatureJ plugin, which is available for download and usage on Fiji, following an adapted and validated protocol which demonstrated to be an efficient semi-automated quantification. It was observed a higher density of ir-CART fibers on medial and ventral territories of the V-SVZ, which happened to be 5 to 10 fold the densitometry of the lateral and dorsolateral counterparts along the anteroposterior axis. Besides that it was also noticed the presence of possible appositions between the ir-CART terminals and ependymal cells and DARPP32 positive striatal cells bodies. Thereby we offer a neuroanatomic approach that amplify the functional and physiological data over a possible existance of a relationship between the CART neuropeptide and neurogenesis on the V-SVZ territory. Key words: neurogenesis; axon; immunohistochemistry