Endocitose da proteína ADAM23 : reciclagem e propriedades de meia-vida longa

Abstract

Resumo: ADAM23 é uma glicoproteína transmembrana tipo I expressa no encéfalo durante o desenvolvimento embrionário e na fase adulta, majoritariamente como uma proteína de superfície celular com provável localização em áreas de contato intercelular. Esta proteína atua em processos de adesão, crescimento de neuritos e arborização dendrítica e no tráfego e expressão de LGI1 na superfície celular neuronal, sugerindo que a endocitose de ADAM23 pode ser um mecanismo regulador dos receptores da membrana plasmática. A regulação da quantidade de ADAM23 na superfície celular através da reciclagem ou degradação pode influenciar nas interações proteína-proteína que afetam a transdução de sinal e os mecanismos celulares, como a adesão e a migração celular. Portanto, decidimos investigar as propriedades de internalização, reciclagem e meia-vida da proteína ADAM23. Com essa finalidade foram realizados ensaios de biotinilação, seguidos do ensaio de internalização de ADAM23 em células N2A. A abordagem experimental de marcação da superfície das células revelou que aproximadamente 75% da ADAM23 biotinilada é internalizada dentro de 60 min (1h), indicando que a proteína é constitutivamente internalizada a partir da membrana plasmática, sendo observada somente a forma madura de 70KDa na membrana. Complementarmente, um ensaio baseado em anticorpos, verificamos que o ADAM23 é reciclado dos compartimentos internos para a membrana plasmática. Em adição, observamos que ADAM23 foi detectada nos lisados de células N2A tratadas com cicloheximida em todos os momentos, se mantendo estável por pelo menos 24 horas após o tratamento. Este dado indica que a proteína ADAM23 possui uma alta estabilidade, com meia-vida superior a 24 horas em células N2A. Em resumo, os resultados apresentados neste estudo sugerem que ADAM23 é uma proteína de meia-vida longa capaz de ser constitutivamente internalizada e reciclada à membrana plasmática. Palavras-chave: Proteínas ADAM. Internalização. Membrana celular. Reciclagem. Disintegrina e Metalloprotease. ADAM23.

Abstract: ADAM23 is a type I transmembrane glycoprotein expressed in the brain during embryonic development and in adulthood, mostly as a cell surface protein with probable localization in areas of intercellular contact. This protein acts in adhesion processes, neurite growth and dendritic arborization. In addition ADAM23 has been involved in the traffic and expression regulation of LGI1 on the neuronal cell surface, suggesting that ADAM23 endocytosis may be a regulatory mechanism for plasma membrane receptors. Because the regulation of the amount of ADAM23 on the cell surface through recycling or degradation could influence protein-protein interactions at cell surface and thereof affect signal transduction, we decided to investigate the internalization, recycling and half-life properties of the ADAM23 protein. For this purpose, biotinylation assays were performed, followed by the ADAM23 internalization assay in N2A cells. The experimental approach of protein labeling on the cell surface revealed that approximately 75% of biotinylated ADAM23 is internalized within 60 min, indicating that the protein is constitutively internalized from the plasma membrane. As expected, only the 70 kDa mature form of ADAM23 was labeled in the membrane and detected after internalization. Employing an antibody-based assay, we also found that ADAM23 is recycled from the intracellular compartments to the plasma membrane. In addition, after pharmacological blocking of protein synthesis by cycloheximide we observed that ADAM23 remained stable for at least 24 hours, indicating that ADAM23 has a high stability property. In summary, the results presented in this study suggest that ADAM23 is a long half-life protein capable of being constitutively internalized and recycled back to the plasma membrane. Key-words: ADAM proteins. Internalization. Cellular membrane. Recycling. A Disintegrin and Metalloprotease. ADAM23.