Adição da superóxido dismutase e do ácido ascórbico como antioxidantes ao diluente optixcell na criopreservação de sêmen bovino

Abstract

Resumo: O processo de criopreservação do sêmen submete os espermatozoides a um grande estresse celular, expondo-os a condições desfavoráveis que dificultam a manutenção da sua viabilidade. Ainda, essas células também sofrem estresse oxidativo, caracterizado pela geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), que ocasiona a peroxidação lipídica, reduzindo a viabilidade espermática. Desse modo, o presente trabalho teve como objetivo testar dois antioxidantes importantes para o controle da geração de ROS, a superóxido dismutase e o ácido ascórbico. Esse trabalho foi dividido em dois capítulos, sendo o primeiro composto por uma revisão bibliográfica sobre estresse oxidativo no sêmen criopreservado bovino e o segundo abordando o experimento realizado para avaliação da ação dos antioxidantes ácido ascórbico e superóxido dismutase após a criopreservação do sêmen bovino. Para o experimento, foram utilizados cinco touros, previamente condicionados a coleta de sêmen. Foram realizadas cinco coletas, com intervalo de dois dias, e em cada uma, forma-se um pool de sêmen (5 pools). Após cada coleta, os pools foram divididos em cinco grupos de tratamento: GC (sem adição de antioxidantes), GAC I (adição 4,5 mg/mL de ácido ascórbico), GAC II (adição de 6,5 mg/mL de ácido ascórbico), GSOD I (adição de 250 U/mL de superóxido dismutase) e GSOD II (adição de 500 U/mL de superóxido dismutase), para depois serem criopreservados e mantidos em botijão criogênica a - 196°C. Realizou-se a avaliação dos parâmetros espermáticos (MT, MP, VAP, VCL, VSL, LIN, STR e ALH), da integridade de membrana (teste hiposmótico) e morfologia espermática (método formol-salina). Ainda, realizou-se avaliações bioquímicas do sêmen, como o potencial antioxidante (FRAP), o teste ácido tiobarbitúrico (TBARS) e a medição das ROS. Após avaliação, constatou-se que a MT foi reduzida nos grupos AC I e SOD II. Do mesmo modo, o GSOD II proporcionou redução significativa da MP. Já os parâmetros de VCL e ALH, o GSODI foi o que demonstrou melhores resultados, e a adição de ácido ascórbico (GAC I e GAC II) reduziu esses valores, quando comparado ao GC. Com relação a LIN e STR, o GAC II demonstrou melhorar esses parâmetros e, em contrapartida, o GSOD I reduziu a LIN e STR, em relação ao GC. Porém, a adição de ácido ascórbico na dose de 6,5 mg/mL (GAC II) aumentou a peroxidação lipídica da membrana espermática, e a adição de SOD na dose de 250 U/mL (GSOD I) reduziu esse estresse oxidativo. Ainda, o ácido ascórbico em ambas doses demonstrou melhor potencial antioxidante, quando comparado aos outros grupos. Palavras-chave: criopreservação, parâmetros espermáticos, espécies reativas de oxigênio, antioxidante

Abstract: The semen cryopreservation process submits sperm to great cellular stress, exposing them to unfavoreble conditions that make it difficult to maintain their viability. Still, the cells also suffer oxidative stress, characterized by the generation of reactive oxygen species (ROS), which causes lipid peroxidation, reducing sperm viability. Thus, the present study aimed to test two important antioxidants for controlling ROS generation, superoxide dismutase and ascorbic acid. This work was divided into two chapters, the first consisting of a bibliographic review on oxidative stress in cryopreserved bovine semen and the second addressing the experiment carried out to evaluate the action of the antioxidants ascorbic acid and superoxide dismutase after the cryopreservation of bovine semen. For the experiment, five bulls were used, previously conditioned to semen collection. Five collections were carried out, with an interval of two days, and in each one, a semen pool is formed (5 pools). After each collection, the pools were divided into five treatment groups: CG (without adding antioxidants), ACG I (adding 4.5 mg/mL of ascorbic acid), ACG II (adding 6.5 mg/mL of ascorbic acid), SODG I (adding 250 U/mL of superoxide dismutase) and SODG II (adding 500 U/mL of superoxide dismutase), to then be cryopreserved and kept in a cryogenic cylinder at -196°C. Sperm parameters (TM, PM, VAP, VCL, VSL, LIN, STR and ALH), membrane integrity (hyposmotic test) and sperm morphology (formalin-saline method) were evaluated. In addition, biochemical evaluations of the semen were performed, such as the antioxidant potential (FRAP), the thiobarbituric acid test (TBARS) and the measurement of ROS. After evaluation, it was found tha TM was reduced in the AC I and SOD II groups. Likewise, SODG II provided a significant reduction in PM. The parameters of VCL and ALH, SODG I showed the best results, and the addition of ascorbic acid (ACG I and ACG II) reduced these values, when compared to CG. With regard to LIN and STR, ACG II demonstrated to improve these parameters and, in contrast, SODG I reduced LIN and STR, in relation to CG. However, the addition of ascorbic acid at a dose of 6.5 mg/mL (ACG II) increased the lipid peroxidation of the sperm membrane, and the addition of SOD at a dose of 250 U/mL (SODG I) reduced this oxidative stress. Still, ascorbic acid in both doses showed better antioxidant potential, when compared to the other groups. Key words: cryopreservation, sperm parameters, reactive oxygen species, antioxidant