Caracterização funcional da Barnettlisina-III (BAR-III), uma metaloprotease do veneno de Bothrops barnetti

Abstract

Resumo: Os acidentes ofídicos são caracterizados pela inoculação de um veneno através das presas da serpente, resultando em sintomas característicos de acordo com a espécie, mas que podem levar a grande incapacitação ou óbito dos pacientes. Portanto, recentemente esses acidentes foram reincluídos na lista de Doenças Tropicais Negligenciados da Organização Mundial da Saúde. No Brasil esses acidentes são divididos em quatro tipos: Crotálicos, Laquéticos, Elapídicos e Botrópicos, sendo este último, responsável por 85% dos acidentes no País. Uma das representantes deste grupo é a Bothrops barnetti que apresenta uma importância epidemiológica maior na região da costa Norte do Peru, sendo o seu veneno hemorrágico e altamente letal. Estudos de proteômica já determinaram a composição proteica do veneno total deste gênero. Eles mostram que a maior parte corresponde à um primeiro grupo de toxinas classificadas como metaloproteases de classe I e III, que são mais correlacionados com as manifestações clínicas do envenenamento, onde as pertencentes à subclasse P-III, que contêm, além do domínio catalítico, os domínios desintegrina e rico em cisteína, normalmente estão relacionadas a um quadro hemorrágico profundo. Uma enzima denominada barnettlisina-III (Bar-III), uma metaloprotease da classe P-III, foi purificada do veneno de Bothrops barnetti. Um ensaio in vivo em camundongo mostrou que a Bar-III apresentou atividade hemorrágica após 24 horas de exposição. Com o objetivo de entender melhor os mecanismos pelos quais a Bar-III provoca hemorragia, a sua atividade sobre componentes da matriz extracelular e sobre células endoteliais foi avaliada. Ensaios bioquímicos mostraram que essa molécula tem atividade gelatinolítica, foi capaz de degradar colágeno I desnaturado e não mostrou atividade sobre colágeno I in natura. A Bar-III degradou parcialmente colágeno IV e não teve atividade sobre laminina e entactina. Além disso, mostrou atividade de degradação parcial sobre fibronectina e degradação total de vitronectina, demonstrando atividade sobre algumas moléculas de matriz, atividade já descrita para metaloproteases de outras espécies de serpentes. Nos ensaios utilizando células em cultura, a Bar-III não apresentou atividade citotóxica sobre células endoteliais, mas foi capaz de interferir na ligação destas células com fibronectina. Verificou-se, também, que a toxina se liga de forma específica na superfície dessas células e que a préincubação das células com a Bar-III em concentração não citotóxica diminui a marcação com anticorpos anti-integrina subunidade ?5, sugerindo uma interação dessa metaloprotease com essa classe de integrinas dessas células. Os resultados apresentados aqui indicam a importância da Bar-III no processo de hemorragia observado no envenenamento por serpentes da espécie Bothrops barnetti. Palavras-chave: 1. Bothrops barnetti, 2. Metaloprotease, 3. SVMPs, 4. Desintegrina, 5. Matriz extracelular.

Abstract: Ophidian accidents are characterized by the inoculation of a venom through the snake's fangs, resulting in characteristic symptoms according to the species, which can lead to great disability or death of the victims. Therefore, these accidents have recently been included in the World Health Organization's list of Neglected Tropical Diseases. In Brazil, these accidents are divided in four types depending on the involved genus, which an be from Crotalus, Lachesis, Elapidae and Bothrops. The Bothropic snakes are responsible for 85% of accidents in the country. One of the representatives of this group is Bothrops barnetti, which has a greater epidemiological importance in the region of the northern coast of Peru, with a hemorrhagic and highly lethal venom. Proteomics studies have already determined the protein composition of the total venom of this genus. They show that the majority of proteins correspond to a first group of toxins classified as metalloproteinases from classes I and III. A second group includes serinoproteases, and a third group corresponds to accessory toxin families. The first two groups are more correlated with the clinical manifestations of the envenoming. In the group of snake venom metalloproteinases (SVMPs) there is a subdivision into classes P-I, P-II and P-III, where those belonging to subclass P-III are usually related to a deep hemorrhagic condition. An enzyme called barnettlisin-III (Bar-III), a class P-III metalloprotease, has been purified from Bothrops barnetti venom. An in vivo mouse trial showed that Bar-III showed hemorrhagic activity after 24 hours of exposure. In order to better understand the mechanisms by which Bar-III causes hemorrhage, the activity of this toxin on components of the extracellular matrix and on endothelial cells was evaluated. Biochemical assays have shown that this molecule has gelatinolytic activity, was able to degrade denatured collagen I and showed no activity on collagen I in natura. Bar-III partially degraded collagen IV and had no activity on laminin and entactin. In addition, it showed degradation activity on fibronectin and on vitronectin, demonstrating activity on some matrix molecules, an activity already described for metalloproteases of other snake species. In assays using cells in culture, Bar-III did not show cytotoxic activity on endothelial cells, but was able to interfere in the binding of these cells with fibronectin. It was also demonstrated that the toxin binds specifically on the surface of these cells and that pre-incubation of the cells with Bar- III in non-cytotoxic concentration reduces the binding of anti-integrin antibodies (?5 subunit), suggesting an interaction of this metalloprotease with this class of integrins. The results presented herein indicate the importance of Bar-III in the hemorrhage process present after accidents with Bothrops barnetti snakes. Keywords: 1. Bothrops barnetti, 2. Metalloprotease, 3. SVMPs, 4. Disintegrin, 5. Extracellular matrix.