Mapeamento da expressão temporal e espacial da proteína ADAM23 e sua participação no desenvolvimento neural
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Data
2005Autor
Brandenburg, Lianara Teresinha Mumbach
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Adesão célula-célula e célula matriz extracelular, bem como o remodelamento da
matriz pela ação de proteases, são vitais para processos normais como morfogênese
tecidual e cicatrização de feridas, assim como verificados em estados patológicos tais
como invasão de células tumorais e metástase. Recentemente, uma nova classe de
moléculas de adesão tem sido descrita, sendo seus membros conhecidos por
desintegrinas celulares . ADAMs, e possuem um domínio de interação a integrinas e
outro de metaloprotease. As ADAMs têm sido implicadas na fusão de membranas
celulares, liberação de fatores de crescimento, migração celular, assim como em
processos de desenvolvimento muscular e fertilização. Um dos membros desta família
denominado ADAM23 / MDC3 é predominantemente expresso no sistema nervoso
sugerindo que a mesma possa funcionar como ligante da integrina .V.3 em células de
origem neural. Nosso grupo recentemente descreveu que o silenciamento do gene
adam23 por metilação está envolvido na progressão de tumores de sistema nervoso.
Devido a pouca descrição espacial e temporal desta proteína no sistema nervoso,
procuramos avaliar a expressão diferencial da desintegrina ADAM23 em diferentes
estágios de desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Para tal objetivo
foram utilizadas as técnicas de imunohistoquímica e Western Blotting empregando
anticorpo policlonal gerado contra o peptídeo 546-570 da ADAM23 humana.
Inicialmente foi possível mostrar que o anticorpo gerado contra a seqüência humana
se liga ao antígeno expresso tanto no cérebro de camundongos como em sistema
heterólogio de E. coli. Desta forma o anticorpo anti-peptideo foi utilizado como
reagente específico no reconhecimento da ADAM23 expressa por camundongos. Para
o isolamento parcial da ADAM23 de cérebros de camundongos foi empregada técnica
de precipitação seqüencial com sulfato de amônio. Foi possível observar que ADAM23
está enriquecida na fração 25% de saturação, comportamento esperado para uma
proteína transmembrânica. Ainda empregando Western Blotting com preparação de
membrana plasmática total de cérebro de camundongos foi mostrada uma expressão
aumentada de ADAM23 em animais recém-nascidos (P6) quando comparada a
animais adultos. Interessantemente quando se utilizam amostras de embriões (fração
25%) a presença de ADAM23 está ainda mais aumentada. Desta forma pode-se
concluir que há um decréscimo da expressão de ADAM23 no sistema nervoso de
camundongos conforme há evolução na maturação do sistema nervoso. Este achado
sugere que esta proteína esteja envolvida com o desenvolvimento e maturação do
sistema nervoso. Espacialmente a ADAM23 possui expressão praticamente
condicionada ao sistema nervoso, uma vez que outras estruturas não são
reconhecidas pelo anticorpo anti-peptideo. Há uma expressão diferencial no cérebro e
no cerebelo dos animais, sendo que no cerebelo está mais expressa em animais P6 e
no cérebro em animais adultos. Apesar destes resultados confirmarem os achados da
literatura que implicam na expressão quase que exclusiva do antígeno no sistema
nervoso, não se pode excluir que, em outras estruturas fora do sistema nervoso, o
epítopo reconhecido pelo anticorpo possa estar escondido ou mesmo expresso em
quantidades abaixo do nível de sensibilidade do método. Tomados em conjunto os
resultados apresentados apontam para uma possível participação da proteína
ADAM23 no desenvolvimento e maturação do sistema nervoso. ADAMs are transmembrane and multidomain proteins that contain a desintegrin
and a metalloprotease activity. Their metalloprotease domain can induce ectodomain
shedding and cleave extracellular matrix protein while desintegrin and cysteine-rich
domains have adhesive properties. The ADAMs family has been implicated in the
control of membrane fusion, cytokine and growth factor shedding, and cell migration as
well as processes such as muscle development, fertilization, and cell fate
determination. Up to now more than 19 adam genes were described, while many lack
functional characterization. Our group recently described that the epigenetic silencing
of ADAM23 member is related with breast cancer development and its downregulation
may be involved in disease progression. Interestingly, ADAM23 has a high expression
in central nervous system, particularly in cerebellum, cerebral cortex and occipital pole.
While ADAM23 role in cell adhesion in neuroblastoma cell model was described, there
is no clue about its role in neurite outgrowth or poor information about its expression
during central nervous system development. Here we describe a new polyclonal
antibody raised against a peptide corresponding to residues 546-570 from human
ADAM23. This antibody recognizes the epitope present in whole molecule expressed in
cultured human glioblastoma cell lines. Furthermore, we could show that this reagent
was able to bind the same protein expressed both in mouse brain and E.coli
heterologous system. Employing ammonium sulfate serial precipitation and crude brain
extract from adult mouse we partially purify ADAM23 in 25% ammonium sulfate
saturation fraction. This behavior agrees with a transmembrane protein located at cell
surface. When we compare ADAM23 expression using crude brain extract from P6
(new born) and adult mice, its expression is increased in the former, but the highest
expression is found in embryo (E16) samples. Then we conclude that there is a
decreasing ADAM23 expression as central nervous system becomes developed. This
result suggests that this protein is probably involved with CNS development and
maturation. Immunohistochemical analysis showed that ADAM23 spatial distribution is
apparently confined in CNS because other non-nervous system structures were not
recognized by anti-peptide antibody. There is a differential expression between
cerebrum and cerebellum during development, since ADAM23 expression increases
and decreases in cerebrum and cerebellum, respectively, from P6 to adult mice.
Although our results confirm some data in the literature, we can not exclude that, in the
case of other tissues, peptide epitope could be buried or is too low to be detected with
the anti-ADAM23 peptide. Collectively our results indicate a probable ADAM23
participation in CNS development and maturation.
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