Clonagem, expressão e caracterização biológica de uma proteína alergênica do veneno de Loxosceles intermedia

Abstract

Resumo: Picadas de aranhas do gênero Loxosceles são acidentes comuns no Brasil. No Paraná, por exemplo, em 2018 foram registrados 4098 casos de Loxoscelismo, termo usado para o conjunto de sintomas decorrentes do envenenamento. A picada por aranhas Loxosceles pode desencadear reações cutâneas e sistêmicas. Isso ocorre devido ao efeito sinérgico das toxinas encontradas no veneno desses animais. Muitas toxinas do veneno de L. intermedia já foram isoladas e caracterizadas, como as fosfolipases-D. Entretanto, toxinas alergênicas não foram ainda estudadas. Há um especial interesse em avaliar suas atividades, pois essa molécula pode estar envolvida em eventos de hipersensibilidade desencadeados pelo loxoscelismo, os quais ainda não foram totalmente elucidados. Uma dessas toxinas de L. intermedia, denominada LALLT (Loxosceles allergen-like toxin), nunca havia sido expressa e sua atividade biológica não havia sido explorada. Com isso, o objetivo deste trabalho foi obter essa molécula recombinante e caracterizar suas atividades biológicas. A expressão da LALLT foi por meio do sistema eucarioto de baculovirus/células de inseto (Sf9). Este modelo de expressão foi escolhido porque as células Sf9 possuem sistema de endomembranas que favorece as modificações pós-traducionais. A sequência codificante da LALLT foi amplificada, clonada no vetor para expressão em baculovírus, o pENTR™/D-TOPO®, e sequenciada. A sequência aminoacídica predita da LALLT revelou similaridade significativa com alérgenos de outras aranhas da família de proteínas CAP/CRISP (cysteine-rich secretory proteins, antigen5, and pathogenesis-related1proteins). Em seguida foi realizada a recombinação, inserção da sequência da LALLT no DNA viral do baculovírus, e esse DNA recombinante foi utilizado para a transfecção nas células Sf9. Os parâmetros para a expressão foram otimizados e a purificação da proteína foi realizada em cromatografia de afinidade por níquel. Foi produzido um soro policlonal anti-LALLT, e os imunoensaios identificaram epitopos lineares (western blotting) e estruturais (ELISA) conservados entre as espécies de L. intermedia, L. laeta e L. gaucho. Nos ensaios biológicos, a LALLT induziu aumento do extravasamento de plasma no ensaio de permeabilidade vascular em camundongos. Além disso, quando aplicada via intradérmica em pele de coelhos causa um edema observado macroscopicamente. Nos cortes histopatológicos da pele desses coelhos foi possível constatar uma desorganização das fibras colágenas e um infiltrado de células do sistema imune. Para confirmar essa atividade edematogênica, foi realizado o ensaio de edema de pata em camundongos, o qual confirmou a capacidade de LALLT de induzir essa alteração, com pico em 20 minutos pós-aplicação e manutenção do edema por até uma hora. A relação da LALLT com o mastócito, célula do sistema imune, foi investigada mais a fundo. A observação de mastócitos em mesentérios de ratos incubados com a LALLT revelou a capacidade da proteína em degranular mastócitos. Diante desses resultados, é possível associar a LALLT a sintomas cutâneos do Loxoscelismo como edema, eritema, exantema. Sendo assim, sugerese que essa proteína possui um papel importante no envenenamento por aranhas do gênero Loxosceles. Entretanto, para investigar mais a fundo as atividades da LALLT, são necessários novos ensaios para entender seus mecanismos frente aos processos associados ao envenenamento. Palavras-chaves: Veneno. toxina alergênica. L. intermedia. Baculovírus. Loxoscelismo. Hipersensibilidade.

Abstract: Bites from Loxosceles spider are common accidents in Brazil. In Parana, for example, in 2018 authorities recorded 4098 cases of Loxoscelism, which is the term that denotes the set of clinical symptoms triggered after the bite of those spiders. The bite from the Loxosceles spiders can cause cutaneous and systemic reactions. This occurs due to the synergic effect of the toxins found in the venom of those animals. Many toxins were already isolated and characterized, like phospholipases- D. However, allergenic toxins were still not studied. There is a special interest in evaluate its activities, since this molecule may be involved in hypersensitivity events caused by Loxosceles venom, which have not yet been fully elucidated. One of those toxins from Loxosceles intermedia, called LALLT (Loxosceles allergen-like toxin), was never evaluated. Therein, the aim of this study was to produce this recombinant molecule and characterize its biological activity. The expression of LALLT was made in the eukaryotic baculovirus-insect cell expression system (Sf9 cells). This model was chosen because it has an endomembrane system. The coding sequence of LALLT was amplified, cloned into the expression vector of baculovirus, pENTR™/DTOPO ®, and sequenced. The predicted aminoacidic sequence of LALLT revealed significant similarities with allergen molecules from other spiders that belong to the CAP (cysteine-rich secretory proteins, antigen5, and pathogenesis-related1proteins) protein family. Then, the recombination and insertion of the sequence of LALLT into the baculovirus DNA was performed, and this recombinant DNA was used to the transfection of Sf9 cells. The expression parameters were optimized and the protein was purified by nickel affinity chromatography. It was produced a polyclonal serum anti-LALLT, and the imunoassays identified linear (western blotting) and structural (ELISA) conserved epitopes among the species of L. intermedia, L. laeta and L. gaucho. In the biological assays, LALLT induced an increase in the extravasation of plasma in the assay of vascular permeability in mouse. Besides that, when injected intradermally in rabbit's skin, it caused a macroscopic edema. In the histopathological sections of this skin, it was observed a disorganization of collagen fibers and the infiltration of cells from immune system. To confirm the edematogenic activity, a paw edema assay in mouse was performed, which confirmed the capacity of LALLT to induce such alteration, showing a peak of edema after 20 minutes of injection and maintenance of this edema for an hour. The relationship of LALLT with an immune cell, the mast cell, was investigated. The visualization of mast cells in the mesentery of rats incubated with LALLT showed that this protein can degranulate mast cells. With these results, it is possible to associate LALLT with cutaneous symptoms of Loxoscelism such as edema, erythema and cutaneous rash. Thus, it is suggested that this protein have an important role in the envenoming by Loxosceles spiders. However, to further understand the activities of LALLT, new assays are needed to understand the mechanisms of this toxin in the process of Loxoscelism. Key Words: Venom. Allergenic toxin. L. intermedia. Baculovirus. Loxoscelism. Hypersensitivity.