Uso de peptideos para diagnóstico imunológico de hanseníase

Abstract

Resumo: A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae que acomete principalmente a pele e os nervos periféricos. Apesar da redução da prevalência no mundo, o número de novos casos tem se mantido constante nos últimos anos. Uma das dificuldades encontradas no controle da doença reside na falta de teste de diagnóstico específico de detecção de infecção por M. leprae. O objetivo desse estudo foi identificar antígenos para fins de diagnóstico. Nesse sentido, peptídeos ligantes de anticorpos de pacientes hansenianos foram selecionados de bibliotecas de peptídeos apresentados em fagos. Dentre sete clones de fagos selecionados, três clones se mostraram promissores e suas sequências peptídicas foram sintetizadas quimicamente. O teste ELISA usando pool dos três peptídeos permitiu identificar 52,2% (12/23) dos pacientes hansenianos multibacilares. Cinco de um total de trinta pacientes (16,7%) com tuberculose apresentaram teste positivo frente aos peptídeos. Nenhuma das amostras de pacientes hansenianos paucibacilares, bem como de contatos de pacientes hansenianos e sadios foi positiva pelo ensaio. Os peptídeos não foram reativos frente aos antisoros de diferentes micobactérias produzidos em coelhos. Peptídeos conjugados a proteína carreadora albumina sérica bovina (BSA) induziram a produção de anticorpos em animais. Os anticorpos antipeptídeos foram capazes de reconhecer antígenos de aproximadamente 30 kDa em M. leprae por Western Blotting. Todos os soros antipeptídeos produziram o mesmo perfil de reatividade por análise de Western Blotting a partir de um gel bidimensional de antígenos de M. leprae, indicando que os peptídeos são derivados de uma mesma proteína do bacilo. Dados experimentais associados aos obtidos por bioinformática indicam que a proteína se trata do antígeno 85B. Dois dos três peptídeos mostraram evidências em estimular células T através de teste de reação de hipersensibilidade do tipo tardio. Os resultados indicaram que os peptídeos são reagentes potenciais em ensaios imunológicos, tanto sorológicos, quanto celulares, para detecção da doença. O uso da metodologia descrita aqui permitirá a identificação de outros peptídeos, que combinados aos propostos neste trabalho, possibilitarão aumentar a sensibilidade do diagnóstico de pacientes hansenianos.

Abstract: Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae that mainly affects the skin and peripheral nerves. Despite reductions in prevalence worldwide, the number of new cases has remained constant in recent years. One of the difficulties in controlling the disease is the lack of specific diagnostic test for detecting infection by M. leprae. The aim of this study was to identify antigens for diagnostic purposes. For these purposes, antibody binding peptides of leprosy patients were selected from phage displayed peptide libraries. Among seven clones of selected phages, three clones were promising and their peptides sequences were chemically synthesized. The ELISA test using three peptides pool permitted the identification of 52.2% (12/23) of multibacillary leprosy patients. Five out of thirty patients (16.7%) with tuberculosis had a positive test with the peptides. None of the samples coming from the paucibacillary leprosy patients, contacts of leprosy patients and healthy individuals for the test were positive. The peptides were not reactive to antisera against different mycobacteria produced in rabbits. The peptides conjugated to the carrier protein bovine serum albumin (BSA) induced the production of antibodies in animals. Antipeptides antibodies were able to recognize antigens of approximately 30 kDa in M. leprae by Western blotting. All sera antipeptides produced the same profile of reactivity by Western blot analysis from a two-dimensional gel of M. leprae antigens, indicating that the peptides are derived from the same bacillus protein. Experimental data associated with those obtained by bioinformatics indicated that the protein is the antigen 85B. Two of the three peptides showed evidence of stimulating T cells through delayed-type hypersensitivity reaction. The results indicated that the peptides are potential reagents in immunological assays, both serologic and cellular, to detect the disease. Using the methodology described here will allow the identification of other peptides, that when matched those proposed in this research, will enable the increase of the sensitivity of leprosy patients diagnosis.