Efeito do TCDD e BDE-209 na citotoxicidade e expressão de proteínas transportadoras ABC: MDR1, MDR5, MRP1, MRP2, MRP4 em linhagem de malanoma murino B16F1

Abstract

Resumo: Os contaminantes ambientais 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) e 2,2',3,3',4,4',5,5',6,6'-decabromodifenil éter (BDE-209), são poluentes denominados orgânico persistentes gerados principalmente durante atividades antrópicas e têm sido lançados constantemente no ambiente. Devido à sua capacidade lipofílica, a exposição a esses contaminantes é frequente, iniciando na fase fetal e se estendendo após o nascimento e pela fase adulta. O melanoma é um tipo de câncer de pele agressivo, em razão de sua capacidade metastática e rápida progressão. Sabe-se que durante o tratamento quimioterápico pode ocorrer uma diminuição dos efeitos dos medicamentos devido ao aumento na expressão e/ou ativação de proteínas transportadoras ABC (ATP binding cassette). Essas proteínas de membrana atuam reconhecendo diferentes compostos e promovem o efluxo de metabólitos celulares, secreção de hormônios, assim como o efluxo de xenobióticos para fora da célula. Essa propriedade faz com que os fármacos presentes no tratamento tenham seus efeitos minimizados exatamente pela ação dessas proteínas transportadoras. No presente estudo, utilizamos a linhagem de melanoma murino B16F1 como modelo experimental para avaliar o papel dos xenobióticos BDE-209 e TCDD nas proteínas de efluxo celular. As células foram cultivadas em meio DMEM com alta glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e antibiótico e incubadas a 37°C e sob 5% de CO2 em atmosfera umidificada. Os ensaios para a investigação de citotoxicidade dos contaminantes ambientais foram MTT, vermelho neutro, cristal violeta e clonogênico. Para a avaliação da atividade das proteínas de efluxo foram realizados o ensaio de MXR e análise da expressão gênica de MDR1; MDR5; MRP1; MRP2 e MRP4, genes de proteínas transportadoras ABC. Para os experimentos, as células foram expostas por 24 horas e 15 dias com o BDE-209 e T cD d , para as concentrações teste de 0,0 1 ; 0,1 e 1,0 nM/mL. Os resultados indicam que o contam inante BDE-209, altera diferentes parâmetros em 24 horas de exposição como: metabolismo lisossomal (t~20% ), expressão gênica dos transportadores ABC: ABCB1 (t~22% ), ABCC1 (t~10% ), ABCC2 (t~27% ) e ABCC4 (t~44% ) e atividade das proteínas transportadoras (4-29%). Com a exposição de 15 dias foi observada alteração dos seguintes parâmetros: metabolismo lisossomal (J~13%), proliferação/adesão celular (t~10% ), expressão gênica de ABCB1(MDR1) (4-3,5%); ABCB5(MDR5) (t~2,5%); ABCC1(MRP1) (t3,5%); ABCC2 (t~1,2%); ABCC4 (~3,0%) e atividade das proteínas transportadoras (t~30% ). Já para o contaminante TCDD, os resultados também apresentaram alterações nos parâmetros em 24 horas de exposição como no metabolismo lisossomal (t~22% ), proliferação/adesão celular (t~23% ) e nos níveis de expressão gênica dos transportadores ABC: ABCB5 (t~42% ), AbCc1 (t~20%), ABCC2 (t~15% ) e ABCC4 (t~33% ) enquanto para a exposição de 15 dias as alterações foram na proliferação/adesão celular (4~ 1 1 %) e expressão gênica de ABCB1 (4-0,2%); ABCB5 (MDR5) (j~1,3% ); ABCC1(MRP1) (t~1,2%); ABCC4 (MRP4) (4-1,5%). Em geral, os dados apresentados sugerem que a exposição aos contaminantes BDE-209 e TCDD, podem estar potencializando a resistência das células do melanoma, tornando-as menos sensíveis ao tratamento quimioterápico, principalmente pela atividade e expressão gênica dos transportadores ABC:PGp e MRP. Esses dados reforçam a importância da busca pela compreensão do risco de exposição humana a xenobióticos. Palavras Chaves: Poluentes orgânicos persistentes (POPs), Proteínas transportadoras ABC, PGP, MRP; Melanoma, B16F1.

Abstract: Environmental contaminants 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) and 2,2 ', 3,3', 4,4 ', 5,5', 6,6'-decabromodiphenyl ether (BDE- 209), are denominated persistent organic pollutants generated primarily during anthropic activities and have been constantly released into the environment. Due to their lipophilic capacity, exposure to these contaminants is frequent, starting in the fetal phase and extending after birth and through adulthood. Melanoma is a type of aggressive skin cancer, featuring metastatic ability and rapid progression. It is known that during chemotherapy treatment there may be a decrease in the drugs effects due to increased expression and/or activation of ATP binding cassette proteins. These membrane proteins act by recognizing different compounds and promote the efflux of cellular metabolites, secretion of hormones, as well as efflux of xenobiotics out of the cell. This property makes the drugs present in the treatment have their effects minimized exactly by the action of these carrier proteins. In the present study, we used the B16F1 murine melanoma line as an experimental model to evaluate the role of the xenobiotics BDE-209 and TCDD in the cellular efflux proteins. The cells were cultured in high glucose DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and antibiotic and incubated at 37 ° C and 5% CO2 in a humidified atmosphere. The assays for the cytotoxicity investigation of environmental contaminants were MTT, neutral red, crystal violet and clonogenic. To evaluate the activity of the efflux proteins were performed the assay MXR and analysis of gene expression the M D r1; MDR5; MRP1; MRP2 and MRp4, ABC carrier protein genes. For the experiments, the cells were exposed for 24 hours and 15 days with BDE-209 and TCDD, at concentrations of 0.01; 0.1 and 1.0 nM/mL. The results indicated that the BDE-209 changes different parameters in 24 hours of exposure, such as: lysosomal metabolism (t~20%), gene expression of ABC transporters: ABCB1 (t~22%), ABCC1 (T~10%), ABCC2 (t~27% ) and ABCC4 (t~44% ) and activity of the ABC carrier proteins (|~29%). With the exposure of 15 days, the following parameters were observed: lysosomal metabolism (|~13%), cell proliferation / adhesion (t~10%), gene expression of ABCB1 (MDR1) (|~3.5%); a B cB 5 (MDR5) (t~2.5%); ABCC1 (MRP1) (t~3.5%); ABCC2 (t~1.2%); ABCC4 (~3.0%) and activity of the ABC carrier proteins (t~30%). For the TCDD, the results also showed alterations in the parameters in 24 hours of exposure as in the lysosomal metabolism (t~22%), cell proliferation/adhesion (t ~23%) and in the levels of ABC expression ABCB5 (t~42%), ABCC1 (t~20%), ABCC2 (t~15% ) and ABCC4 (t~33% ) while for the 15 day exposure the changes were in cell proliferation/adhesion (|~11% ) and ABCB1 gene expression (|~0.2%); ABCB5 (MDR5) (|~1.3%); ABCC1 (MRP1) (t1.2%); ABCC4 (MRP4) (|~1.5%). In general, the data presented suggest that exposure to BDE-209 and TCDD may be potentiating the resistance of melanoma cells, making them less sensitive to chemotherapeutic treatment, mainly due to the activity and gene expression of ABC: PGP and MRP transporters. These data reinforce the importance of the search for the understanding of the risk of human exposure to xenobiotics. Keywords: Persistent organic pollutants (POPs), ATP-binding cassette (ABC), PGP, MRP; Melanoma, B16F1.