Análise antigênica e genômica dos adenovírus isolados em pacientes pediátricos atendidos no Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná

Abstract

Resumo: O Adenovírus humano foi descrito em 1953 e apresenta considerável relevância nas infecções respiratórias, devido à elevada frequência e gravidade das manifestações clínicas. Nas infecções respiratórias agudas vem sendo um dos principais motivos de mortalidade mundial em crianças menores de cinco anos. Os objetivos do presente estudo foram padronizar a técnica de detecção genética do adenovírus humano para introdução na rotina do laboratório de virologia do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná; comparar as características operacionais do método de biologia molecular padronizado com as técnicas de pesquisa de antígeno viral e isolamento celular para o adenovírus humano; estudar a caracterização genômica viral e sua associação com a evolução clínica de adenovírus humano isolados em amostras de aspirado de nasofaringe desde o ano de 1996 até o ano de 2008; relatar aspectos epidemiológicos e clínicos dos pacientes pediátricos do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná infectados por adenovírus humano. O estudo foi realizado retrospectivamente em 22 amostras armazenadas de aspirado de nasofaringe e prospectivamente em 11 amostras. O DNA foi extraído utilizando o método do tiocianato de guanidina e a nested PCR foi realizada para amplificar um fragmento de 168 pb do gene hexon do adenovírus. A subtipagem dos vírus detectados foi realizada por enzima de restrição e por sequenciamento genético. Os dados clínicos dos pacientes infectados foram obtidos dos prontuários médicos. A nested PCR foi padronizada, para o gene hexon, no setor de biologia molecular do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná. Os subgêneros encontrados por enzima de restrição e sequenciamento foram B:1, B:2, C e D. Foram obtidas 31 sequências para o gene VA-RNA, das quais, 19 representam sequências de consenso entre ambas as fitas do DNA, enquanto em outras 12 apenas uma das fitas apresentava condições para análise. A análise da árvore filogenética foi organizada com as sequências nucleotídicas obtidas para o gene VA-RNA. Os valores de divergência genética entre as amostras obtidas por este estudo identificadas como de um mesmo grupo apresentaram uma grande variação, com os altos valores de divergência sendo encontrados nos subgêneros B:1 tipo 3 e B:1 sorotipo 7 e baixos valores de divergência entre as demais linhagens. Os resultados de cultura de células demonstraram uma maior sensibilidade do que a Imunofluorescência e menor sensibilidade do que os resultados da PCR. A incidência do HAdV foi maior em crianças com idade inferior a dois anos. Os sintomas mais observados foram taquipneia, esforço respiratório, febre, taquicardia e tosse. Houve coinfecções virais em seis casos (18,2%). Doze pacientes hospitalizados (36%) evoluíram para o óbito. Os subgêneros que mais levaram à internação em Unidade de Tratamento Intensivo e a óbito foram B:1 e C. Palavras-chave: Adenovírus humanos; Análise de sequência de DNA; Filogenia; Infecção respiratória; Sintomas; Evolução fatal.

Abstract: The adenovirus was described in 1953 and has considerable significance in respiratory infections due to high frequency and severity of clinical manifestations. Acute respiratory infections have been a major source of global mortality in children under five years. The objectives of this study were to standardize the molecular detection of adenovirus for introduction into the routine at the virology laboratory of the Hospital de Clinicas, Federal University of Paraná (HC-UFPR), to compare the operational characteristics of the molecular biology method with standard techniques of viral antigen research and isolation in cell culture to study viral genomic characterization study and its association with clinical isolates of adenovirus in nasopharyngeal aspirate samples from the year 1996 until the year 2008, reporting epidemiological and clinical aspects of pediatric patients infected with adenovirus at HC-UFPR. The study was conducted retrospectively on 22 nasopharyngeal aspirate stored samples and prospectively in 11. DNA was extracted using the guanidine thiocyanate method and nested PCR was performed to amplify a 168 bp fragment of the adenovirus hexon gene. The subtyping of the virus was performed by restriction enzyme and genetic sequencing. The clinical data of infected patients were obtained from medical records. The nested PCR was standardized in the laboratory of molecular biology of the HC-UFPR. The subgenus found by restriction enzyme and sequencing were B:1, B:2, C and D. It was obtained 31 sequences for the VA-RNA gene, of which 19 represent consensus sequences of both strands of DNA, while in the remaining only is could be analysed. The incidence of adenovirus was higher in children younger than two years. The symptoms observed were tachypnea, respiratory distress, fever, tachycardia, and coughing. There was viral co-infections in six cases (18.2%). Twelve hospitalized patients (36%) died. The analysis of phylogenetic tree was organized with the nucleotide sequences obtained for the VARNA gene. The values of genetic divergence among the samples obtained by this study identified as a group varied widely, with high values of divergence being found in subgenus B:1 serotype 3 and serotype 7 and low levels of divergence between the other strains. The subgenus that led to more admissions in the Intensive Care Unit and death were B:1 and C. The results of cell culture showed a higher sensitivity than the immunofluorescence and lower sensitivity than the PCR. Key words: Adenoviruses human, Sequence analysis DNA, Phylogeny, Respiratory infection, Symptoms, Fatal outcome.