Expressão de RNAs não codificantes longos no inicio da diferenciação de células-tronco adultas derivadas de tecido adiposo

Abstract

Resumo: RNAs não codificantes longos (lncRNAs) possuem um importante papel na regulação transcricional e pós-transcricional. São classificados como transcritos maiores que 200 nucleotídeos, que não apresentam potencial de codificar proteínas, sendo observados tanto no núcleo como no citoplasma. Novos estudos tem demonstrado a grande importância destes RNAs na diferenciação celular, porém pouco se compreende a cerca de sua dinâmica e de seus mecanismos de ação, principalmente nos processos de diferenciação de células-tronco adultas. O objetivo deste trabalho foi estudar o perfil de expressão dos lncRNAs logo no disparo inicial da diferenciação, além de sua associação aos polissomos em células-tronco adultas. Utilizamos sequenciamento em larga escala (RNA-Seq) dos RNAs associados aos polissomos e da fração total, obtidos através da técnica de Polysome Profile de células-tronco adultas derivadas de tecido adiposo submetidas a 24h de diferenciação osteogênica e adipogênica. Com isso, verificamos a expressão diferencial de 46 lncRNAs na fração total e 73 lncRNAs na fração polissomal após a indução osteogênica e 76 lncRNAs na fração total e 89 lncRNAs na fração polissomal após a indução adipogênica. Todos estes lncRNAs foram classificados e caracterizados de acordo com suas localizações genômicas, comprimento, número de éxons, conteúdo GC, estrutura e potencial codificante. Curiosamente, ao compararmos os lncRNAs com expressão diferencial nas frações total e polissomal, notamos que há poucos transcritos comuns entre elas, o que nos indica possíveis funções distintas entre os RNAs das frações. Além disso, ao compararmos as duas diferenciações, poucos lncRNAs comuns entre elas foram visualizados da mesma forma, demonstrando assim, que logo no início da diferenciação (24h) há uma clara distinção da regulação transcricional e pós-transcricional de lncRNAs durante a adipogênese e osteogênese. Alguns lncRNAs polissomais relacionados ao processo de diferenciação foram selecionados para a validação do RNA-seq, sendo demonstrados sua expressão durante todo o processo de diferenciação osteogênica (21 dias) e adipogênica (14 dias), além de comprovarmos a associação destes lncRNAs aos polissomos através da técnica de Polysome Profiling com adição do inibidor da tradução puromicina. Podemos concluir que, a expressão de lncRNAs durante o disparo inicial da diferenciação celular se mostrou bastante específica, inclusive em relação aos lncRNAs associados aos polissomos, denotando uma ampla regulação transcricional e pós transcricional logo no primeiro dia das diferenciações osteogênica e adipogênica. Palavras-chave: lncRNAs; polissomo, diferenciação, células-tronco, pós-transcricional e transcricional.

Abstract: Long non-coding RNAs (lncRNAs) play an important role in transcriptional and posttranscriptional regulation. They are classified as transcripts greater than 200 nucleotides, which don't possible to encode proteins, being observed either in the nucleus and cytoplasm. New studies demonstrated a great importance of these RNAs in cell differentiation, though there is no complete understanding of their dynamics and mechanisms of action, especially during adult stem cell differentiation. The objective of this work was to study the expression profile of lncRNAs at the initial step of differentiation, and also its association with polysomes in adult stem cells. We used the large-scale sequencing (RNA-Seq) of both, total fraction and the RNAs associated with the polysomes, obtained from adipose tissue-derived adult stem cells previously submitted to 24h of adipogenic and osteogenic differentiation through the Polysome Profiling. Accordingly, we verified the differential expression of 46 lncRNAs in the total fraction and 73 lncRNAs in the polysomal fraction after osteogenic induction. After the adipogenic induction we found 76 lncRNAs in the total fraction and 89 lncRNAs in the polysomal fraction. These lncRNAs were classified and characterized according to their locations, size, number of exons, GC content, structure and coding potential. Interestingly, when comparing differential expressed lncRNAs in total and polysomal fractions, we noticed that there are only few common transcripts between them, which indicates different functions and regulation for the lncRNAs which were exclusive to each fractions. In addition, when comparing the two differentiations, few common lncRNAs were visualized between the two processes demonstrating that in early steps of differentiation (24h) there is a clear distinction between the transcriptional and posttranscriptional regulation of lncRNAs. Some polysomal lncRNAs envolved in differentiation process were selected for the validation of RNA-Seq. For this, lncRNAs expression was demonstrated during the whole process of osteogenic (21 days) and adipogenic (14 days) differentiation. Besides, we proved the association of these lncRNAs with the polysomes through Polysome Profiling technique with addition of the puromycin. We can conclude that; the expression of lncRNAs during the initial steps of cell differentiation was quite specific, including the lncRNAs associated with polysome, denoting a wide transcriptional and posttranscriptional regulation right after the first day of osteogenic and adipogenic differentiations. Keywords: lncRNAs; polysome; differentiation; stem cells; posttranscriptional and transcriptional.