Desenvolvimento de fragmentos de anticorpos recombinantes para detecção e inibição da osteopontina

Abstract

Resumo: A osteopontina é uma glicoproteína fosforilada secretada, para a qual são atribuídas funções na biomineralização, reabsorção óssea e no sistema imune. Seu mecanismo de ação é mediado por receptores de membrana celular, incluindo integrinas e CD44. Desregulação de osteopontina tem sido associada a processos patológicos como doenças autoimunes e progressão de tumores. Como seu nível de expressão encontra-se aumentado em uma variedade de cânceres, a osteopontina pode servir como um biomarcador nestas condições, podendo ser também um alvo para terapia. Dentre as ferramentas bioquímicas que podem ser usadas tanto para detecção como para inibir a ação da osteopontina estão os anticorpos. Para aplicações biotecnológicas e biomédicas podem ser usados fragmentos de anticorpos contendo apenas a parte de ligação ao antígeno, como é o caso da fração de ligação ao antígeno (Fab) e dos fragmentos de cadeia única da fração variável (scFv). O presente trabalho tem como objetivo a produção de três fragmentos de anticorpos recombinantes do tipo scFv (denominados 14-8, 14-9 e 14-10) e de dois fragmentos do tipo Fab (14-8 e 14-10) para detecção e inibição da osteopontina. Genes sintéticos que codificam scFv e Fab otimizados para expressão em Escherichia coli e em Pichia pastoris, respectivamente, foram adquiridos pela empresa GenScript. Foram realizados testes de expressão dos fragmentos de anticorpos do tipo Fab em Pichia pastoris. O fragmento do tipo Fab 14-10 foi obtido em baixos níveis, enquanto que para o Fab 14-8 não houve expressão. Foram realizados testes de expressão dos fragmentos de anticorpos do tipo scFv em Escherichia coli com subsequente purificação parcial. A osteopontina em fusão com EGFP, e em fusão com GST também foram expressas em E. coli. Todas as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade. O rendimento dos scFvs foi relativamente baixo (0,5 mg/L de cultura) mas suficiente para sua caracterização subsequente. Os anticorpos do tipo scFv foram testados em ensaios de Western blot e de termoforese em microescala para determinação se estes apresentam a capacidade de reconhecer a osteopontina. Através dos ensaios de Western blot foi possível observar que apenas o scFv 14-8 conseguiu detectar a osteopontina, enquanto que no ensaio de termoforese em microescala, a qual é uma técnica mais sensível, todos os fragmentos do tipo scFv conseguiram detectar a osteopontina. Foi estimada a constante de dissociação para os fragmentos de anticorpos do tipo scFv 14-8 e 14-10, sendo estas de 75,8 nM e 364,7 nM, respectivamente. Com base nos valores de kd resultantes obtidos, podemos concluir que os fragmentos de anticorpos do tipo scFv apresentam as especificações necessárias para testar o seu uso na detecção e inibição da osteopontina. Palavras-chave: Osteopontina. scFv. Fab. Expressão de proteínas recombinantes. Pichia pastoris.

Abstract: Osteopontin is a secreted phosphorylated glycoprotein, which acts in biomineralization, bone resorption and in the immune system. Its mechanism of action is mediated by cell membrane receptors, including integrins and CD44. Osteopontin disfunction has been associated with pathological processes such as autoimmune diseases and tumor progression. The expression level of osteopontin is increased in a variety of cancers, indicating that it can serve as a biomarker of cancer and possibly also be a target for therapy. Among the biochemical tools that can be used for detection and inhibition of osteopontin are the antibodies. Modified antibodies with only the functional site of antigen binding, such as antigen-binding fragments (Fab) and single chain fragment variable (scFv) can be used for biomedical and biotechnological applications. The objective of this work is the production of three scFv fragments (14-8, 14-9 e 14-10) and two Fab fragments (14-8 and 14-10) for the detection and inhibition of osteopontin. Fab and scFv synthetic genes optimized for Pichia pastoris and Escherichia coli expression, respectively, were acquired from GenScript. Expression of Fab fragments was performed in Pichia pastoris. However, only one of the Fab (14-10) was obtained at low levels, while the other was not expressed. The scFv fragments were expressed in E. coli and partially purified by affinity chromatography. Osteopontin in fusion with EGFP and with GST were also expressed in E. coli. All recombinant proteins were purified using affinity chromatography. The yield of the scFv fragments was relatively low (~0,5 mg/L of culture) but sufficient for subsequent characterization. Interaction of osteopontin with antibody fragments was tested by Western blot and by microscale thermophoresis. Only one scFv antibody (14-8) was shown to detect osteopontin by Western blot. However, using microscale thermophoresis, which is a far more sensitive method, osteopontin was detected by all three scFv antibodies. The estimated dissociation constant for the scFv 14-8 and scFv 14-10 antibody fragments was 75,8 nM and 364,7 nM, respectively. These kd values are in the acceptable range to test their potential to detect and inhibit osteopontin. Key-words: Osteopontin. scFv. Fab. Expression of recombinant proteins. Pichia pastoris.