Production of secondary compounds in Ilex paraguariensis A. St. Hill. callus culture

Abstract

Resumo: A espécie Ilex paraguariensis A. St. Hill. (erva-mate) fornece uma ampla variedade de compostos bioativos, e a cultura de calos in vitro é uma alternativa para a produção desses compostos em condições otimizadas e controladas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de compostos secundários na cultura de calos de erva-mate. Para isso, avaliou-se o potencial de indução da calogênese de dez clones. Posteriormente, o clone mais responsivo foi utilizado para avaliar o efeito de diferentes concentrações de citocininas e sacarose no crescimento. O efeito da sacarose também foi verificado na produção de compostos secundários, compostos fenólicos e atividade antioxidante de calos de erva-mate. Após otimizar as condições de cultura, dois clones foram selecionados para verificar a cinética de crescimento dos calos e o efeito da radiação ultravioleta no acúmulo de fenólicos totais e compostos secundários. Observou-se que o clone 6-156-6 foi mais responsivo à indução de calos (77%). O uso de 4,56 ?M de zeatina associada a 4,52 ?M de 2,4-D e 3% de sacarose apresentou maiores médias de peso fresco. Maiores rendimentos de fenólicos totais e compostos secundários foram observados em calos crescidos em meio de cultura contendo 3% de sacarose. A atividade antioxidante, os compostos cafeína e ácido 3,5-dicafeoilquínico não foram afetados pela alteração das concentrações de sacarose. Cinco fases de crescimento foram observadas em calos da erva-mate (lag, linear, exponencial, desaceleração e estacionária). O acúmulo de compostos fenólicos, atividade antioxidante e compostos secundários foi maior durante a fase estacionária de crescimento, na qual recomenda-se a extração de tais compostos. Os resultados demonstraram que a resposta à radiação UV-C é genótipo-dependente e o conteúdo de fenólicos totais e compostos secundários depende dos tempos de exposição e incubação. Nas condições testadas, a radiação UV-C não foi eficiente para aumentar a produção de compostos secundários em calos de Ilex paraguariensis. Este estudo descreveu pela primeira vez a produção e identificação de compostos secundários de calos de erva-mate cultivados in vitro, sendo os principais compostos teobromina, cafeína, ácido clorogênico, ácido criptoclorogênico, ácido neoclorogênico, ácido 3,4-dicafeoilquínico, ácido 3,5- dicafeoilquínico e ácido 4,5-dicafeoilquínico. Em síntese, as condições de crescimento dos calos foram otimizadas, a cinética de crescimento foi entendida e foi possível produzir compostos secundários a partir de calos de erva-mate sob condições controladas. Finalmente, esse procedimento também pode ser usado como uma ferramenta para compreender a via metabólica desses importantes compostos na erva-mate. Palavras-chave: Ilex paraguariensis, genótipo, fenólicos totais, elicitação HPLC, metabólitos secundários.

Abstract: The species Ilex paraguariensis A. St. Hill. (yerba mate) provide a wide variety of bioactive compounds, and the in vitro callus culture is an alternative for the production of these compounds in an optimized and controlled condition. The objective of this study was to evaluate the production of secondary compounds in yerba mate callus culture. For this, the callogenesis induction potential of ten clones was evaluated. Subsequently, the most responsive clone was used to evaluate the effect of different cytokinins and sucrose concentrations on growth. The effect of sucrose was also verified on the production of secondary compounds, phenolic compounds and antioxidant activity of yerba mate callus. After optimizing the culture conditions, two clones were selected to verify the kinetics of callus growth, and the effect of ultraviolet radiation on the accumulation of total phenolic and secondary compounds. It was observed that clone 6-156-6 was more responsive to callus induction (77%). The use of 4.56 ?M zeatin associated with 4.52 ?M 2,4-D and 3% sucrose exhibited higher averages of callus fresh weight. Higher yields of total phenolic and secondary compounds occurred in callus grown using 3% sucrose in the culture medium. The antioxidant activity, caffeine, and 3,5-dicaffeoylquinic acid were not affected by the alteration of sucrose concentrations. Five growth stages were identified in yerba mate callus (lag, linear, exponential, deceleration and stationary). The accumulation of phenolic compounds, antioxidant activity, and secondary compounds was higher during the stationary phase of growth, which it is recommended the extraction of such compounds. The results demonstrated that the response to UV-C radiation is genotype dependent and the content of total phenolic and secondary compounds depends on the exposure and incubation times. Under the tested conditions, UV-C radiation was not efficient to increase the production of secondary compounds in Ilex paraguariensis callus. This study described for the first time the production and identification of secondary compounds from yerba mate callus in vitro cultivated, being the major compounds theobromine, caffeine, chlorogenic, cryptochlorogenic, neochlorogenic, 3,4-dicaffeoylquinic, 3,5- dicaffeoylquinic and 4,5-dicaffeoylquinic acid. In resume, the callus growth conditions were optimized, growth kinetics was understood and it was possible to produce secondary compounds from yerba mate callus under controlled conditions. Finally, such procedure can also be used as a tool to understand the metabolic pathway leading to these important compounds in the yerba mate. Keywords: Ilex paraguariensis, genotype, total phenolics, elicitation, HPLC, secondary metabolites.