Isolamento de fragmentos de anticospors para quantificação de EGF humano

Abstract

Resumo: Diversos são os mecanismos envolvidos no desenvolvimento tumoral, dentre eles desregulação de vias de sinalização através de receptores e seus ligantes. Sabe-se, por exemplo, a importância do receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) no desenvolvimento de alguns tipos de tumores, incluindo os pulmonares. No entanto, não se sabe se seus ligantes estão envolvidos ou não na dinâmica tumoral devido à falta de métodos precisos o suficiente para distingui-los e quantifica-los. Nesse contexto, anticorpos têm diversas aplicações, dentre elas a detecção de biomoléculas. No entanto, para que os mesmos sejam usados no desenvolvimento tecnológico eles devem passar em critérios de qualidade para precisão, exatidão, linearidade, limite de detecção e limite de quantificação, especificidade, reprodutibilidade, estabilidade e recuperação adequadas. A maturação de anticorpos é uma estratégia promissora para otimizar a especificidade e sensibilidade. Outra estratégia é a seleção de fragmentos de anticorpos de domínio único (sdAfs), os quais se diferenciam de anticorpos clássicos e seus derivados por sua facilidade de produção e maior estabilidade. Temos como objetivo desenvolver um fragmento de anticorpo do tipo Fab através da maturação de anticorpos anti-EGF e de construir uma biblioteca sintética para ser utilizada no sistema de duplo-híbrido de levedura. Estes fragmentos serão utilizados para avaliar as interações dos mesmos com os membros da família do fator de crescimento epidermal (EGF). Dois anticorpos adquiridos comercialmente sem restrição de uso foram sequenciados por espectrometria de massas. Sequencias completas de aminoácidos foram obtidas, cuja qualidade foi avaliada com base numa combinação de parâmetros tais como qualidade da fragmentação dos peptídeos, cobertura, conservação, dentre outros. As sequencias de aminoácidos obtidas foram avaliadas através de métodos computacionais, incluindo modelagem molecular por homologia e docking para verificar a confiabilidade do sequenciamento. As sequencias de aminoácidos obtidas por espectrometria de massas foram também usadas para se obter genes sintéticos otimizados para expressão em leveduras. Estes genes foram subclonados em vetores de expressão de Komagataella phapphi (anteriormente denominada Pichai pastoris) e Saccharomyces cerevisiae. Diferentes condições de expressão foram testadas, no entanto, devido à instabilidade genômica, a dinamicidade do sistema e as diversas variáveis que afetam a produção de proteínas recombinantes, não foi possível o isolamento dos fragmentos de anticorpos a partir da expressão em nestas leveduras. Já a biblioteca sintética foi desenhada utilizando-se uma sequência molde para as porções estruturais conservadas, enquanto a região determinante de complementariedade (CDR) 3 foi definida levando-se em conta a frequência de cada aminoácido em cada posição da CDR3 de fragmentos já sequenciados. Desenhou-se um esquema de construção para aumentar a probabilidade de inclusão na biblioteca de resíduos mais propensos a fazer ligações específicas. Já as outras duas CDRs foram construídas utilizando-se de estratégia baseada em código binário de tirosina e serina, além de aminoácidos altamente conservados dentro das CDRs. Sendo assim, nesse trabalho foi possível estabelecer o duplo-híbrido de levedura, assim como desenvolver a biblioteca sintética de sdAf in-silico. Concomitantemente, foram sequenciados com sucesso dois anticorpos comerciais e adquiridos genes sintéticos. Estes foram subclonados para vetores de leveduras, entretanto, não foi possível a produção dos Fabs nos sistemas e condições realizadas até o momento. Palavras-chave: sdAf, Fab, Komagatella phaffii, biblioteca sintética

Abstract: Several mechanisms are are responsible for tumor development, including deregulation of signaling pathways through receptors and their ligands. It is known, for example, the importance of the epidermal growth factor receptor (EGFR) in the development of some types of tumors, including in lung cancer. However, it is not known whether their ligands are involved in tumor dynamics because precise methods to distinguish and quantify them are not currently available. For applications such as detection of biomoleculas, antibodies are of particular interest. However, in order for an antibody to be suitable for technological development, it must pass a set of quality criteria concerning precision, accuracy, linearity, limit of detection and limit of quantification, specificity, reproducibility, stability and adequate recovery. Maturation is a promising strategy to optimize antibody specificity and sensitivity. Another strategy is the selection of fragments of single domain antibodies (sdAfs), which differ from classical antibodies and their derivatives by their ease of production and greater stability. We aim to develop a Fab-like antibody fragment by maturation of anti-EGF antibodies and to construct a synthetic library for use in the yeast two-hybrid system. These fragments will be used to assess their interactions with members of the epidermal growth factor (EGF) family. Two commercially purchased antibodies purchased without utilization restriction were sequenced by mass spectrometry. The quality of the sequences was evaluated based on a combination of parameters such as quality of peptide fragmentation, coverage, conservation, among others. The amino acid sequences were evaluated using computational methods, including homology modeling and molecular docking. The amino acid sequences were also used to obtain synthetic genes optimized for yeast expression. They were subcloned in expression vectors for Komagataella phapphi (previously named Pichai pastoris) and Saccharomyces cerevisiae. Various expression assays were performed using different culture conditions. However, due to genomic instability, system dynamics and the various variables affecting the production of recombinant proteins, it was not possible to isolate the antibody fragments. The synthetic library was designed using a template sequence for the conserved structural portions, while the complementarity-determining region (CDR) 3 was defined by taking into account the frequency of each amino acid at each CDR3 position of already sequenced fragments. A construction scheme was designed to increase the likelihood of inclusion in the library of residues more likely to make specific binding. The other two CDRs were constructed using strategy based on binary code of tyrosine and serine, in addition to highly conserved amino acids within the CDRs. Thus, in this work it was possible to establish the yeast two-hybrid system, as well as to develop the synthetic sdAf in silico library. Concomitantly, two commercial antibodies were successfully sequenced and synthetic genes were purchased. These were subcloned into yeast vectors, however, it was not possible to produce the Fabs in the systems and conditions performed so far. Key words: sdAf, Fab, Komagatella phaffii, synthetic library