Avaliação de desenvolvimento de Phyllostica citricarpa em seu hospedeiro Citrus sp., através de observação de mutantes fluorescentes e quantificação de DNA por qPCR

Abstract

Resumo: A Mancha Preta do Citros (MPC) é causada pelo fungo Phyllosticta citricarpa e afeta praticamente todas as linhagens comerciais de Citros. Está presente em todos os continentes, com exceção da Europa, e causa pontuações escuras, descoloração, lesões deprimidas e manchas pretas na casca do fruto. Para fins de controle da doença, pontos importantes da relação entre a planta hospedeira e o patógeno precisam ser elucidados. O gênero Phyllosticta inclui 3.000 espécies, sendo até o momento, 46 espécies bem resolvidas filogeneticamente, e compreende fitopatógenos e endofíticos. O fungo P. citricarpa é hospedeiro específico, pois é isolado exclusivamente de plantas cítricas, enquanto outras espécies deste gênero, como P. capitalensis, são capazes de colonizar a planta de citros e diversos outros hospedeiros de maneira assintomática e também como patógeno de diversas culturas. O esclarecimento do estilo de vida de cada espécie é extremamente importante para o entendimento e controle das doenças. Desta forma, o presente trabalho teve como foco o estudo da interação das espécies P. citricarpa e P. capitalensis com plantas de citros, utilizando duas diferentes metodologias. A primeira foi o estudo da interação de P. citricarpa e P. capitalensis em folhas de citros aderidas a planta e após serem destacadas. Para tanto, foram obtidas e utilizadas linhagens expressando genes repórteres para proteínas fluorescentes. Os processos de infecção e colonização foram observados em microscopia de fluorescência. Os resultados sugerem diferentes estilos de vida para as duas espécies, sendo que ambas penetram no tecido de folhas destacadas de citros, enquanto somente P. capitalensis apresentou penetração quando a folha permanece aderida à planta. Na segunda metodologia empregada, foi realizada a análise do processo de colonização de tecidos da casca de frutos cítricos pela espécie Phyllosticta citricarpa, em frutos destacados e não destacados. Para tanto, frutos foram inoculados em diferentes condições e foi avaliada a quantidade de DNA do fungo recuperado 0, 3, 7, 14 e 21 dias após a inoculação. A quantificação do DNA recuperado a partir dos tecidos do fruto foi realizada por meio de qPCR. O experimento foi realizado utilizando-se duas fontes de inóculo: micélio e suspensão de esporos. Observou-se que quando o micélio é inoculado, o desenvolvimento nos primeiros 14 dias após a inoculação (dpi) é crescente, e atinge um crescimento exponencial entre o 14º e o 21º dpi. Quando a suspensão de esporos foi utilizada, houve pouca variação na quantidade de DNA de P. citricarpa recuperado até o 14º dpi. Entre o 14º e o 21º dpi, houve crescimento exponencial, resultante da germinação dos esporos e subsequente colonização do fruto pelo fungo. Não foram encontradas diferenças entre o desenvolvimento do fungo em frutos destacados ou mantidos na planta, para ambas as formas de inoculação. A sonda de Van Gent- Pelzer et. al (2007) detectou com sucesso o DNA do fungo nas amostras, mesmo quando em pequenas quantidades, mas apontou falso-positivos em amostras controle contendo P. capitalensis. Dessa forma, o seu uso não é recomendado como único método de avaliação qualitativa para a presença de P. citricarpa em amostras de frutos. Palavras-chave: Phyllosticta citricarpa, Phyllosticta capitalensis, Mancha Preta do Citros, PCR em tempo real, transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens.

Abstract: Citrus Black Spot (CBS) is caused by the pathogenic fungal Phyllosticta citricicarpa and affects virtually all commercial strains of Citrus. It is present worldwide, except Europe, and causes discoloration, depressed lesions and black spots on the fruit skin. So the disease can be controlled, some important points of the relationship between the host plant and the pathogen need to be elucidated. Thus, in this paper, we focus on the study of the interaction with P. citricicarpa and its host plant through two strategies. One it was the transformation of strains of P. citricicarpa and P. capitalensis, a species capable of colonizing citrus plants asymptomaticly, to obtain transformants capable of expressing the reporter protein DsRed. The transformants were then inoculated on dettached and attached leaves and the development was observed by microscopy. The evaluation resulted in signs of colonization by both species in dettached leaves, but only P. capitalensis was abble to enter the leaves that remains adhered to the plant, suggesting an better colonization capacity to the endophytic fungus. Another approach to experimentation focused on the study of methods for inducing symptoms, by inoculation of a strain of P. citricicarpa in attached and dettached fruits, and avaluating the amount of DNA of the fungus five times (day 0, day 3, day 7, day 14 and day 21 after inoculation). Since the induction studies are conducted with dettached fruits, and the disease occuring in the field in fruits that are still dettached, it is important to investigate possible differences between the behaviors of the fungus in both situations. It was possible to follow the development process of the fungus inoculated either as mycelium or as spore, in both dettached and attached fruits. When the mycelium is inoculated, the development in the first 14 days after inoculation increases, and reaches an exponential growth between the 14th and the 21th day. When the spore suspension was inoculated, there is little variation in the amount of DNA until the 14th. Between the 14th and the 21th day, there is an exponential growth, resulting from the outbreak of the spore and subsequent colonization of the fruit by the fungus. No differences were found between the development of the fungus in detached or attached fruits, for both forms of inoculation. The Van Gent-Pelzer et. al (2007) probe successfully detected the DNA of the fungus in the samples, even in small amounts, but noted false positives in control samples containing P. capitalensis. Thus, its use is not recommended as sole method of qualitative assessment for the presence of P. citricicarpa in fruit samples. Keywords : Phyllosticta capitalensis , Phyllosticta citricicarpa , Citrus Black Spot, realtime PCR , transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens.