Validação de promotor de Eucalyptus grandis EM Nicotiana tabacum e transformação de Populus tremula x P. alba com o fator de transcrição CaHB12

Abstract

Resumo: RESUMO 0 metilparabeno (MEP) é uma substância amplamente utilizada como conservante em produtos de cuidados pessoais e em alimentos. Devido ao seu uso intenso em aplicações industriais tem sido frequentemente detectado no meio ambiente, indicando que os tratamentos convencionais não estão sendo adequados para a total remoção deste composto. Alguns estudos têm demonstrado que o MEP pode atuar como uma substância desreguladora endócrina, associando-se à ocorrência de câncer em humanos e a toxicidade crônica em organismos aquáticos. 0s processos oxidativos avançados tem se demonstrado eficiente técnica para a remoção de compostos de baixa biodegradabilidade, resistentes a degradação por meio dos processos convencionais. Neste trabalho foi avaliada a degradação e mineralização do composto metilparabeno por meio dos processos oxidativos avançados fotocatálise heterogênea e ozonização. 0s estudos da fotocatálise heterogênea foram realizados em um reator em batelada com uma temperatura controlada em 25ºC, analisando a influência das radiações UV-A, UV-C e Vis em um planejamento fatorial 24, avaliando as condições operacionais: pH inicial da solução (3-9), concentração inicial da solução de metilparabeno (30-50 mgL-1), quantidade do fotocatalisador Ti02 (300-500 mgL-1) e tempo reacional na variável resposta: percentual de degradação do MEP. Foi demonstrada a elevada capacidade de degradação do processo quando aplicado em condições experimentais otimizadas (pH: 9; [MEP]=30 mgL-1;Ti02=500 mgL-1). Nessas condições, a completa degradação do MEP foi alcançada em 75 minutos de reação no processo assistido pelo uso da radiação UV-C, quando se utilizou a radiação UV-A o processo também atingiu uma eficiente degradação, em 90 minutos de reação a taxa de degradação do MEP foi de 88%. Entretanto, nos processos de simulação da radiação solar (Vis), o processo não apresentou alta capacidade para degradar o MEP, indicando um baixo percentual de degradação (23%) em um tempo reacional de 90 minutos. As análises de mineralização mostraram uma maior remoção do carbono orgânico total (T0C) para as reações assistidas com a radiação UV-C, alcançando taxas de 77 % em 90 minutos de reação. 0 modelo cinético de Langmuir-Hinshelwood foi adequado aos dados experimentais obtidos nas reações de fotocatálise heterogênea. Na segunda etapa do trabalho, foi avaliado os processos de ozonização, utilizou-se um planejamento fatorial 24 para investigar a influência da concentração de ozônio (10 a 30 mgL-1), da concentração inicial de MEP (30-50 mgL-1), do pH inicial da solução (3,6 e 9) e da temperatura de reação (20 a 40 ºC) na degradação do MEP . Foi observado que quando se aplicou uma dose de ozônio de 30 mgL-1 , concentração de MEP (30 mg L-1 com pH =9) e a temperatura da reação em 20 ºC, a solução apresentou uma degradação de 98% do composto em 15 minutos de reação. A mineralização nessas mesmas condições, porém em um tempo reacional de 90 minutos, foi de aproximadamente 40%. Além da aplicação do processo ozonização, os processos combinados com ozônio (03/UV e 03/UV/Ti02) foram estudados nas condições ótimas obtidas para a reação de ozonização (ou seja, pH = 9, T = 20ºC, 03 =30 mgL-1 e [MEP]= 30 mgL-1) com o intuito de aumentar a eficiência da mineralização do composto. 0 processo mais eficiente tanto para degradação quanto para a mineralização do MEP foi a combinação 03/UV/Ti02, atingindo a degradação completa em tempos de reação menores que 10 minutos e mineralização superior a 93% em 90 minutos de reação. A ausência da toxicidade da solução de MEP após o tratamento com os processos oxidativos avançados (fotocatálise heterogênea, ozonização e 03/UV/Ti02) foi confirmada por meio dos testes in vivo com o micro crustáceo Artemia Salina. Palavras chave: Desreguladores Endócrinos. Fotocatálise Heterogênea. 0zonização. Ti02. Radiação. Toxicidade ABSTRACT Plantas modelo são usadas para estudos de caracterização de genes e promotores, pois tem seus protocolos de transformação e regeneração definidos. Nicotiana tabacum e Populus sp. são exemplos de plantas modelo que são transformadas facilmente e eficientemente com um DNA exógeno. Neste trabalho foram usadas plantas de Nicotiana tabacum para validar o promotor G02172 fusionado ao gene gus e plantas de Populus tremula x P. alba clone 717-1B4 foram transformadas para validar o fator de transcrição CaHB12. Em trabalhos anteriores, o promotor G02172 foi isolado de Eucalyptus grandis e o gene deste promotor foi definido com expressão específica em raízes. Assim, plantas de tabaco transformadas com este promotor foram estudadas a fim de validar a expressão especifica nas raízes. Dez eventos com o promotor G02172 e um com o promotor CaMV35S, ambos fusionados ao gene gus e ao gene gfp, foram analisados via PCR. Em seguida, foi realizado o teste histoquímico e de quantificação do gene gus para a visualização da atividade da enzima ?-glucuronidase. A presença da proteína não foi especifica nas raízes do tabaco, no entanto houve maior expressão do gene gus nas raízes e nos caules. Portanto, o promotor G02172 foi considerado um promotor preferencialmente expresso em caules e raízes em Nicotiana tabacum. Um segundo estudo de validação foi realizado usando o fator de transcrição CaHB12 da família HD-Zip-I em plantas de Populus tremula x P. alba clone 717-1B4. Este fator de transcrição foi isolado de Coffea arabica e está envolvido na resposta a tolerância à seca. Foram verificados via PCR oito eventos contendo o gene CaHB12. Em seguida, foi realizado o Southern Blot que permitiu estabelecer que quatro dos oito eventos eram o mesmo evento e que tinham duas cópias do gene CaHB12. O evento 1 e plantas não transformadas foram submetidos ao estresse osmótico in vitro. Estas plantas foram mantidas em meio de cultura MS suplementado com 300 mM de manitol, 30 g L-1 de sacarose e 7 g L-1 de ágar. Após 60 dias, observou-se o melhor desenvolvimento dos eventos do que as plantas controle. Estas plantas foram usadas para extração e quantificação de prolina. Não houve diferença estatística na quantidade de prolina entre o evento e o controle. Três eventos foram aclimatizados e avaliados morfologicamente, e após 60 dias, não houve diferenças estatísticas entre eles mostrando que o fenótipo das plantas se manteve inalterado. Dois regimes de estresse hídrico foram aplicados aos três eventos aclimatizados e aos controles. No primeiro regime, houve um estresse severo onde foi cessada a rega por 15 dias e todas as plantas morreram. No segundo, foi realizado um estresse moderado com uma rega semanal. Após 15 dias, estas plantas foram avaliadas para número de folhas, comprimento e largura de folhas. Houve diferenças estatísticas entre os resultados, sendo que as plantas controle sempre obtiveram as médias menores. Assim, pode-se concluir que o fator de transcrição CaHB12 teve influência positiva na tolerância à seca de plantas de Populus tremula x P. alba clone 717-1B4. Palavras-chave: HD-Zip-I, tolerância à seca, promotor raiz-específico.

Abstract:Model plants are used for characterization studies of genes and promoters, as they have their transformation and regeneration protocols well defined. Nicotiana tabacum and Populus sp. are examples of model plants that are easily and efficiently with an exogenous DNA transformed. In this study, Nicotiana tabacum plants were used to validate the G02172 promoter fused to the gus gene and plants of Populus tremula x P. alba clone 717-1B4 were transformed to validate the transcription factor CaHB12. In a previous study, the G02172 promoter was isolated from Eucalyptus grandis and it was shown that the promotor gene was specifically expressed in roots Thus, tobacco plants transformed with this promoter were studied in order to validate the specific expression in the roots. Ten events with the G02172 promoter and one with the CaMV35S promoter, both fused to the gus gene and the gfp gene, were analyzed via PCR. Next, the histochemical and quantification test of the gus gene was performed to visualize the activity of the enzyme â-glucuronidase. The presence of the protein was not specific in the tobacco roots; however there was a greater expression of the gus gene in the roots and stems. Therefore, the G02172 promoter was considered a promoter preferentially expressed in stems and roots in Nicotiana tabacum. A second validation study was performed using the CaHB12 transcription factor of the HD-Zip-I family in plants of Populus tremula x P. alba clone 717-1B4. This transcription factor was isolated from Coffea arabica and is involved in the response to drought tolerance. Eight events containing the CaHB12 gene were verified via PCR. Southern Blot was then performed to establish that four of the eight events were the same event and had two copies of the CaHB12 gene. Event 1 and untransformed plants were submitted to osmotic stress in vitro. These plants were maintained in MS culture medium supplemented with 300 mM mannitol, 30 g L-1 sucrose and 7 g L-1 agar. After 60 days, the events had a better development than the control plants. These plants were used for extraction and quantification of proline. There was no statistical difference in the amount of proline between the event and the control. Three events were acclimatized and evaluated morphologically and, after 60 days, there were no statistical differences between them showing that the plant phenotype remained unchanged. Two water stress regimes were applied to the three acclimatized events and control plants. In the first regime wher a severe stress was applied, with watering stopped for 15 days,all the plants died. In the second regime, a moderate stress was carried out with a weekly irrigation. After 15 days, these plants were evaluated for leaf number, length and width. There were statistical differences between the results, and the control plants always obtained the smaller means. Thus, it can be concluded that the transcription factor CaHB12 had a positive influence on the drought tolerance of plants of Populus tremula x P. alba clone 717-1B4. Key words: HD-Zip-I, drought tolerance, root-specific promoter.