Clonagem, sequenciamento e caracterização do gene que codifica a enzima DNA topoisomerase do tipo II do protozoário Blastocrithidia culicis (Brueske, 1967)

Abstract

DNA topoisomerases são enzimas que participam de diversos processos celulares tais como replicação, transcrição, recombinação e segregação dos cromossomos. Tais enzimas atuam clivando transitoriamente uma fita (topoisomerases do tipoI) ou ambas (topoisomerases do tipoII) as fitas da molécula de DNA. As topoisomerases são alvos de agentes bactericidas e de drogas anti-tumorais e podem vir a ser um importante alvo para quimioterapia de doenças causadas por parasitas Neste trabalho nos clonamos e caracterizamos o gene que codifica a enzima topo II do tripanosomatídeo monoxênico Blastocrithidia culicis (BcTOP2), uma vez que, esta enzima pode vir a ser usada como protótipo pra topoisomerases de tripanosomatídeos patogênicos e conseqüentemente um excelente modelo para estudos funcionais e estruturais. O gene BcTOP2 apresentou um quadro aberto de leitura com 3,693 pares de bases, codificando um polipeptídio de 1.230 aminoácidos com uma massa molecular estimada de 138kDa. A seqüência de aminoácidos da topoII de B. culicis apresenta uma alta similaridade com topoisomerases de outros tripanosomatídeos, tais como C. fasciculata (81.0%), L. infantum (79.0%), Trypanosoma cruzi (76.0%) e Trypanosoma brucei (74.0%). Bctopo II apresenta uma menor similaridade com a topoII humana (48.0%). BcTOP2 é um gene de copia única no genoma de B. culicis e transcreve um mRNA de 4.5 kb. O antisoro produzido em coelho contra a porção carboxiterminal de BctopoII fusionada a GFP detectou, por imuno blot, uma banda com aproximadamente 138 kDa em extratos celulares de B. culicis, que é compatível com a massa do polipeptídeo, cuja seqüência foi deduzida a partir do gene BcTOP2. Ensaios de imunolocalização mostraram que o antisoro reconhece uma TOPOII nuclear

DNA topoisomerases are involved in cellular processes as diverse as replication, transcription, recombination and chromosome segregation. Such enzymes acts by transiently cutting one (type I) or both (typeII) strands of the DNA. DNA topoisomerases are inhibited by antimicrobial and antitumoral agents and might be also important targets in the chemotherapy of diseases caused by parasites. We have cloned and characterized the gene encoding the topoII from the monoxenic trypanosomatid B. culicis (BcTOP2), since this enzyme might be used as a prototype for topoII enzymes from pathogenic trypanosomatids and consequently a good model for structural and functional studies. The BcTOP2 gene revealed an open reading frame of 3,693 base pairs predicting a protein with 1,230 amino acids and an estimated molecular weight of 138 kDa. The B. culicis topo II amino acid sequence shares high similarity with topoisomerases from other trypanosomatids, such as C. fasciculata (81.0%), L. infantum (79.0%), Trypanosoma cruzi (76.0%) and Trypanosoma brucei (74.0%). Bctopo II shares a lower similarity with the human homologs topo II (48.0%). BcTOP2 is a single copy gene in the genome of B. culicis and encodes a 4.5-kb mRNA. Antiserum raised against a C-terminal portion of BctopoII fused to GFP could detect a band of 138 kDa in imuno blot, the expected size of the polypeptide deduced from the BcTOP2 gene. Immunolocalisation assays showed that the antiserum recognized the nuclear TOPOII .