Análise da expressão e localização subcelular das proteínas urease e allantoicase em Colletotrichum graminicola utilizando mutantes URE1:EGFP e ALA1:EGFP

Abstract

Resumo: O Brasil destaca-se por ser o terceiro maior produtor mundial de milho, entretanto, apesar desta alta produtividade, esta cultura é afetada por um grande número de doenças. Estas doenças acarretam em perdas na produção, sendo a antracnose uma das doenças fúngicas com maior relevância, de distribuição mundial. O fungo responsável pela antracnose é o Colletotrichum graminicola. Em estudos funcionais de genes associados a virulência e patogenicidade nesta espécie, foi demonstrado que o processo de penetração na planta é atenuado em transformantes com mutação ou deleção dos genes allantoicase e/ou urease (MÜNCH et al, 2011, GLIENKE et al, 2015). Com base nesses trabalhos sugere-se que as enzimas allantoicase e urease são importantes para os estágios iniciais do processo de infecção no hospedeiro por C. graminicola. A fim de determinar em que estágio do desenvolvimento do fungo e onde essas enzimas celulares atuam neste fitopatógeno, foram obtidos e analisados mutantes de C. graminicola para os genes urease e allantoicase (ALA1:eGFP e URE1:eGFP), os quais apresentam fusão dos genes alvo com o gene repórter eGFP. Os mutantes foram caracterizados, sendo selecionados somente aqueles que apresentavam cópia única do cassete inserido no local correto e fluorescência em microscopia. Todos os mutantes apresentando essas características, assim como três ectópicos referentes a cada transformação foram avaliados quanto aos sintomas produzidos em folhas de milho destacadas, localização subcelular através do gene repórter, quanto ao crescimento em meio de cultura com restrição de nitrogênio, bem como a atividade das enzimas urease e allantoicase. Com base nos resultados de microscopia de fluorescência, sugere-se que as enzimas urease e allantoicase estão presentes principalmente no citoplasma de esporos de C. graminicola antes da germinação e formação de apressório, sendo que a fluorescência é fortemente reduzida nos estágios iniciais do processo de infecção, ou seja, em tubos germinativos, em hifas de penetração e biotróficas. Nenhuma fluorescência foi observada em hifas necrotróficas do fungo. Palavras-chave: Zea mays, Colletotrichum graminicola, eGFP, urease, allantoicase.

Abstract: Brazil is the third largest producer of maize in the world, however despite this productivity, the culture is affected by a large number of diseases, which lead to losses in production. Anthracnose is one of the main fungal diseases and has a worldwide distribution. The fungus responsible for the anthracnose disease is Colletotrichum graminicola. In functional studies of genes associated with virulence and pathogenicity processes in this specie, it has been shown that the plant penetration process is attenuated in transformants with mutation or deletion of allantoicase and/or urease genes (GLIENKE et al, 2015; MÜNCH et al, 2011). Based on these studies, it is suggested that the enzymes allantoicase and urease are important to the initial penetration stages for C. graminicola. To determine the development stage and the cellular location these enzymes act in this pathogen, the objective was to obtain and analyze C. graminicola mutants (ALA1:eGFP and URE1:eGFP) with fusion of the target genes, allantoicase and urease, with the reporter gene eGFP. The mutants were characterized and only those which presented a single copy of the construct in the right position and fluorescence in microscopy were selected. All the selected mutants and three ectopics for each gene were evaluated by produced symptoms in detached maize leaves, cellular localization through the reporter gene, ability to grow in nitrogen limitation medium, as well as the enzymes activity for urease and allantoicase gene. Based on the results, we conclude that the enzymes urease and allantoicase are present mainly in the cytoplasm of the C. graminicola conidia before germination and appressoria formation, the fluorescence is severely reduced in the initial stage of infection, i.e. in germ tube and biotrophic and penetration hyphae. No fluorescence was observed in necrotrophic hyphae of C. graminicola. Keywordse: Zea mays, Colletotrichum graminicola, eGFP, urease, allantoicase.