Aspectos evolutivos e impacto funcional de Polimorfismos dos genes CD80 e CD86

Abstract

Resumo: CD80 e CD86, também denominados B7.1 e B7.2, são genes proximamente ligados no cromossomo 3 que codificam glicoproteinas da superfamília das imunoglobulinas, expressas na superfície das células apresentadoras de antígeno. Essas moléculas participam na ativação e inibição das células T através da ligação aos receptores CD28 e CTLA-4. Nesse estudo foram analizados polimorfismos dos genes CD80 e CD86 com o objetivo de investigar a diversidade genética, microevolução e relevância funcional. Foram genotipados 1.124 indivíduos, incluindo brasileiros de ancestralidade predominantemente européia, mista africana e européia e japonesa, 5 populações ameríndias e africanos. As regiões promotoras de CD80 e CD86 foram sequenciadas e utilizadas em ensaios de gene repórter com luciferase em células HEK293T. As proteínas foram quantificadas por citometria de fluxo em monócitos, estimulados com quatro ligantes de TLR, de indivíduos com diferentes genótipos. Sítios de ligação de fatores de transcrição foram inferidos in silico. Todos os alelos analisados foram encontrados em africanos, o que sugere sua origem na África antes das migrações humanas para fora do continente. Cinco novos alelos da região promotora de CD80 foram identificados e confirmados por clonagem e sequenciamento, sendo o promotor 2 o mais provável alelo ancestral. Foi encontrado um efeito de seleção balanceadora em descendentes de japoneses, nos quais todos os alelos apresentam frequências elevadas. O nucleotídeo -79 é monomórfico em 4 populações ameríndias, nas quais a presença do alelo -79G é provavelmente resultado de fluxo gênico. O haplótipo 4 de CD80 apresentou expressão significativamente menor do que os demais devido ao SNP g.-7T>C (rs16829980), g.5C>A (rs41271391) e/ou 287A>T (rs56124423). O SNP g.-7T>C está localizado no sítio de ligação da proteína ativadora AP-1 e de acordo com inferências in silico interfere na ligação. No gene CD86, dois SNPs foram analisados em 2.4 kb incluindo o promotor e a 5'UTR. O SNP CD86 -298T>C não interfere na expressão gênica segundo os experimentos com a luciferase. A quantidade das proteínas em monócitos diferiu significativamente entre os haplótipo de CD80 e os alelos -819T>C (rs11575855) de CD86 e também entre idosos e jovens e entre os quatro diferentes estímulos utilizados. Concluímos que polimorfismos na região 3' do promotor de CD80 alteram significativamente a atividade do promotor. O SNP CD86 -819T>C altera os níveis proteicos de CD86 na membrana de monócitos estimulados. As diferenças encontradas são provavelmente devidas a alterações na capacidade de ligação de fatores de transcrição.

Abstract: CD80 and CD86, also called B7.1 and B7.2, are closely linked genes on chromosome 3 that code for glycoproteins of the immunoglobulin superfamily, expressed on the surface of antigen-presenting cells. These costimulatory molecules play essential roles for stimulation and inhibition of T cells through binding to CD28 and CTLA-4 receptors. In this study, CD80 and CD86 polymorphisms were analyzed to investigate the genetic diversity, microevolution, and the functional relevance of CD80 and CD86 promoter polymorphisms. We genotyped 1,124 individuals, including Brazilians of predominantly European, mixed African and European, and Japanese ancestry, 5 Amerindian populations, and an African sample. The CD80 and CD86 promoter regions were sequenced and functional studies were done using luciferase reporter assays in HEK293T cells, flow cytometry measurements of protein on TLR stimulated monocytes (using four different stimuli) of individuals with different genotypes, and in silico inferences of transcription factor binding. All variants were observed in Africans, which suggests their origin in Africa before the human migrations out of that continent. Five new CD80 promoter alleles were identified and confirmed by cloning and sequencing, and promoter 2 is most likely the ancestral allele. There is evidence of an effect of balancing selection in Japanese-brazilians, where all alleles present high frequencies. Nucleotide-79 is monomorphic in 4 Amerindian populations, where the presence of the -79G allele is probably the result of gene flow from non-Amerindians. CD80 haplotype 4 showed significantly lower promoter activity, caused by SNPs g.-7T>C (rs16829980), g.5C>A (rs41271391) and/or 287A>T (rs56124423). The SNP g.-7T>C is located in the previously reported binding site of activating protein 1 (AP-1) and is predicted to interfere with AP-1 binding. In CD86, two SNPs were analyzed in the 2.4 kb including the promoter and 5'UTR of the gene. Luciferase measurements showed that the CD86 -298T>C SNP did not interfere in gene expression. The protein expression on monocytes differed significantly among CD80 haplotypes and CD86 -819T>C (rs11575855) alleles, and also between age groups and the different stimuli given to the cells. We conclude that polymorphisms within the 3' end of the CD80 promoter significantly affect the activity of the promoter. Further, the CD86 -819T>C SNP has a significant effect on protein levels on the membrane of stimulated monocytes. These differences are most likely caused by differential binding of transcription factors.