Produção de enzimas amilolíticas fúngicas a-amilase e amiloglucosidase por fermentação no estado sólido

Abstract

Resumo: As amilases são enzimas que hidrolisam moléculas de amido liberando diversos produtos incluindo dextrinas e progressivamente pequenos polímeros compostos por unidades de glicose. Atualmente as amilases apresentam grande importância na biotecnologia com um amplo campo de aplicações. Na indústria de alimentos, as amilases são empregadas na liquefação do amido para a obtenção de glicose, em produtos de panificação, em cervejarias e bebidas fermentadas, em cereais para alimentação infantil como também são aplicadas na ração animal. Existem outras áreas para aplicação das amilases, tais como: indústria de papel e celulose, indústria têxtil, indústria de detergentes e produtos de limpeza, indústria química e farmacêutica, na produção de vitaminas e antibióticos. Embora enzimas de origem microbiana industriais sejam produzidas principalmente por fermentação submersa (FSm), a fermentação no estado sólido (FES) representa um método tradicional e preferido em alguns países, possuindo um grande potencial para a produção de enzimas amilolíticas, que exige baixa tecnologia e oferece maior economia. O objetivo do presente trabalho é apresentar alternativas para a produção das enzimas amilolíticas a-amilase e amiloglucosidase por fungos do gênero Aspergillus e Rhizopus através da fermentação no estado sólido. Um resíduo sólido da indústria açucareira, o bagaço de cana-deaçúcar, foi empregado como suporte inerte e a fécula de mandioca foi o substrato utilizado nas fermentações sólidas, suplementada com fonte de cálcio, fonte de nitrogênio e solução salina. Diferentes condições de processo foram otimizadas com o intuito de obter o máximo rendimento da produção de a-amilase e amiloglucosidase, através do emprego de delineamentos experimentais aplicados à Metodologia de Superfície de Resposta. A capacidade de produção das enzimas foi testada em 12 diferentes espécies de Rhizopus e em 8 diferentes cepas de Aspergillus. Uma linhagem de Aspergillus niger LPB 28 foi selecionada com maior capacidade de produção de a-amilase e amiloglucosidase. A taxa de inoculação estudada variou de 107 a 108esporos/g MS. Os experimentos foram conduzidos em frascos Erlenmeyer e em bandejas. O pH inicial estudado oscilou entre 4.0 e 8.0; a temperatura de incubação foi testada de 25º a 35ºC; tempo de fermentação de 48, 54, 60 e 72 horas; umidade inicial da fermentação foi variada entre 80 e 90% e as proporções de substrato/suporte (fécula/bagaço) estudadas foram (1/1; 1,5/1; 2/1; 1/1,5; 1/2; 3/1; 1/3). Estudos foram realizados para verificar a diferença de produção dessas enzimas pela FES em frascos e em bandejas assim como através da FSm. A máxima produção de a-amilase e amiloglucosidase foram alcançadas com os seguintes parâmetros de processo: 30-32ºC fermentação; proporção fécula/bagaço (2/1); 90% umidade inicial; 10% fonte de nitrogênio inorgânico (KNO3); 30% solução salina, =5% CaCO3; 5% fécula e 1,0-5,5x107esporos/g MS; 60 horas de fermentação; pH inicial=4,0. As melhores condições de extração foram: agitador tipo shaker à 30ºC, 120 rpm e 60 minutos de agitação. Para a dosagem, a temperatura de incubação ideal foi de 55ºC. Na FSm, a maior produção das enzimas foi alcançada com concentração de substrato de 1,0% porém a produção foi inferior à produção por FES. A FES conduzida em bandeja apresentou produção de amiloglucosidase 22,12% maior em relação à FES conduzida em frascos e a produção de a-amilase foi 19,9% superior.

Abstract: Amylases are enzymes which hydrolyse starch molecules to give diverse products including dextrins and progressively smaller polymers composed of glucose units. Amylases are of great significance nowadays in biotechnology with a wide field of applications. In food industries, amylases are employed to hydrolyse starch molecules to obtain glucose, in bakery products, in beer industries and others fermented drinks, in baby foods and in animal feed too. There are others fields of amylases production, such as paper industry, textile industry, chemical and pharmaceutical industry to vitamins and antibiotic production. Though industrial enzymes of microbial origin are produced mainly by submerged fermentation (SF), solid state fermentation (SSF) represents a traditional and favored method in some countries and holds tremendous potential for the amylolytic enzymes production, improving economy and low technology. The objective of this work is to present alternatives for a-amylase and amyloglucosidase production under solid state fermentation by Aspergillus and Rhizopus. A solid residue from sugar industries, the sugar cane bagasse, has been used as inert support impregnated with starch cassava and supplemented with KNO3, CaCO3 and salts solution Different processes conditions were studied to achieved maximum yield of a-amylase and amyloglucosidase production, using experimental design applied to Surface Response Methodology. The capacity of a-amylase and amyloglucosidase production was tested in twelve different Rhizopus species and in eight different Aspergillus. A strain of Aspergillus niger has been selected as the great capacity to produce these enzymes. The spores concentration used was 107 -108 spores/dried material. The experiments were carried in Erlenmeyer flasks and in tray-type bioreactor. The initial pH studied was 4.0 to 8.0; incubation temperature 25º to 35ºC; fermentation time (48, 54, 60 and 72 hours); initial moisture content of fermentation was varied between 80, 85 and 90% and the substrate/support proportion (cassava starch/sugar cane bagasse) studied were (1/1; 1.5/1; 2/1; 1/1.5; 1/2; 3/1; 1/3). Studies were realized to verify the difference between the enzymes production carried by SSF in flasks and in tray-type bioreactor such as by submerged fermentation (SF). The maximum yield of a-amylase and amyloglucosidase were achieved with the follows process parameters: fermentation temperature (30-32ºC); proportion between starch/bagasse (2/1); initial moisture (90%); inorganic nitrogen source (10% KNO3); 30% salts solution; =5% of CaCO3; starch concentration (5%); spores concentration: 1.0-5.5x107 spores/g dried material; fermentation time: 60 hours; pH initial=4.0. The best extraction conditions were: shaker agitator at 30ºC, 120 rpm and 60 minutes of agitation. The enzymatic dosage the best incubation temperature was 45-55ºC. In submerged fermentation (SF), the best a-amylase and amyloglucosidase production were achieved with 1.0% starch concentration but lower than SSF enzymes production. The SSF carried in tray-type bioreactor shows 19.9% superior a-amylase production and 22.12% superior amyloglucosidase production when compared to SSF carried in flasks.